我國北方地區鯉浮腫病毒的流行情況調查與監測分析

徐立蒲 王小亮 李 清 王立新 曹 歡 王 姝張 文 潘 勇 王靜波

(1. 北京市水產技術推廣站, 北京 100176; 2. 全國水產技術推廣總站, 北京 100125)

鯉(Cyprinus carpioLinnaeus)是中國主要的淡水養殖品種之一。2015年, 鯉的養殖產量3.36×109kg,占淡水魚類養殖總產量的12.4%。其中山東省、遼寧省、河南省和黑龍江省產量最高, 均在2×108kg以上。錦鯉(Cyprinus carpio var koi)為鯉的變種, 是中國重要的觀賞魚養殖品種之一[1]。近年來, 我國河南、河北、遼寧等多個省份養殖的鯉和錦鯉多次暴發一種被廣大養殖者稱為“鯉急性爛鰓病”的疾病。該病發病急、死亡率高, 已造成嚴重經濟損失, 僅河南沿黃灘區每年的直接經濟損失就高達5000萬元以上[2]。根據已有報道, 該病的癥狀和發病特點與錦鯉皰疹病毒病(Koi Herpes Virus Disease,KHVD)[3]和鯉浮腫病(Carp Edema Virus Disease,CEVD)或稱為錦鯉昏睡病(Koi Sleepy Disease, KSD)[4,5]都有相似之處。由于KHVD自2002年在我國首次發現后一直為我國鯉科魚類主要病毒類疾病, 故該病發生以來一直認為是KHVD, 但多次樣品檢測結果呈KHV陰性。于2016年在確診我國發生了CEVD[6—8]之后, 因為KHVD和CEVD兩病癥狀的相似, 引起漁業主管部門高度重視, 我們經實驗室檢測和對河南沿黃灘區養殖的鯉(包括錦鯉)暴發的該病調查[9], 證實該病的主要病原為CEV。

鑒于近年該病暴發日益嚴重的現狀, 為更多了解CEVD在我國流行現狀和流行特點, 本文在暴發該病的我國北方地區5省市開展重點調查, 同時在9省市的鯉和錦鯉養殖場進行CEV的隨機監測, 了解CEVD的流行現狀和流行特點, 為疫病防控提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品來源樣品來源有2種, 一是重點調查采樣, 在河北、河南、遼寧、北京、內蒙古自治區的26個正在發生或曾經發生(指發病已經停止至少15d, 但有爛鰓癥狀)疑似CEVD的養殖場取樣。每個養殖場取3—10尾有爛鰓、凹眼等典型癥狀的魚,即為1個樣品, 采集時均記錄水溫、品種、魚規格等信息。樣品信息見表1。二是隨機監測, 依托國家水生動物疫病監測計劃的鯉春病毒血癥病毒(Spring Viraemia of Carp Virus, SVCV)和錦鯉皰疹病毒(Koi Herpes Virus, KHV)的監測項目。2017年4—9月, 抽取了黑龍江、遼寧、內蒙古自治區、北京、山西、陜西、寧夏回族自治區、新疆維吾爾自治區和河南共9個省的97家鯉和錦鯉養殖場樣品。每個養殖場隨機取150尾活魚為1個樣品, 樣品魚多數未出現疾病癥狀。采樣時水溫13—27℃。將樣品按省市來源、采樣日期、采樣水溫(20℃以下還是20℃以上)、品種、樣品魚規格(12 cm以下還是12 cm以上)等進行分類, 樣品信息見表2—表5。

儀器與試劑PCR儀為ABI Veriti型梯度PCR儀, 熒光PCR為AB 7500型。2×Master PCR Mix試劑購自北京百泰克生物技術有限公司, DNA抽提試劑盒為德國QIAGEN公司生產, nest PCR以及qPCR所用引物、探針等均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

表1 重點調查的“鯉急性爛鰓病”樣品的基本信息及CEV和KHV檢測結果Tab. 1 Basic information and testing results of CEV and KHV for investigating samples suspected “acute gill-rot disease of carp”

1.2 方法

樣品處理樣品處理參考KHV檢測標準[11]。重點調查采集的樣品：取魚鰓、肝、腦、脾、腎,混合后研磨, 為保護病毒, 按1∶5加入含10%胎牛血清的M199細胞培養液, 凍融1次以釋放病毒。隨機監測采集的樣品：取每尾魚的鰓、肝、腦、脾、腎, 為提高病毒檢出率每10—15尾魚的組織混成1個小樣, 混合后研磨, 按1∶5加含10%胎牛血清的M199細胞培養液, 凍融1次以釋放病毒。樣品均采用DNA抽提試劑盒抽提核酸, 備用。

CEV檢測方法重點調查采集的樣品采用Oyamatsu等[12]建立的nest PCR方法和英國環境、漁業水產養殖研究中心(Center for Environment,Fisheries and Aquaculture Science, CEFAS)[13]建立的qPCR方法進行CEV檢測; 同時采用行業標準《SC/T 7212.1-2011鯉皰疹病毒檢測方法 第1部分：錦鯉皰疹病毒》進行KHV檢測[11]。隨機監測的樣品使用CEFAS[13]建立的qPCR方法進行CEV檢測。

按以下方法進行結果判斷：qPCR方法結果以Ct值小于等于35, 且出現擴增曲線, 判定為陽性; 大于35小于40, 有擴增曲線的判為可疑, 重復1次后結果仍一致的判為陽性; 大于35, 未出現擴增曲線的判為陰性。nest PCR方法以陽性、陰性、空白對照正常情況下, 擴增出目的條帶判定為陽性。qPCR和nest PCR中任何一種檢測方法為陽性, 則判定樣品為CEV陽性。

CEV部分基因測序與分析將隨機監測時CEV檢測呈陽性的樣品按CEFAS[13]建立的nest PCR方法進行528和478 bp基因片段擴增, 擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序結果通過NCBI的BLAST檢索系統進行同源性分析, 從中選取與所測序列同源性較高毒株序列,使用MEGA 4.0軟件的鄰位相連法(Neighbor-joining)構建進化樹, 通過自舉分析進行置信度檢測, 自舉數集1000次。

表2 不同地區的鯉或錦鯉養殖場CEV檢出率Tab. 2 CEV-positive rates of carp or koi farms in different study regions

表3 不同采樣水溫的鯉或錦鯉養殖場CEV檢出率Tab. 3 CEV-positive rates of carp or koi farms according to temperature of water samples

表4 不同樣品規格的鯉或錦鯉養殖場CEV檢出率Tab. 4 CEV-positive rates of carp or koi farms according to size of fish

表5 鯉和錦鯉養殖場CEV檢出率Tab. 5 CEV-positive rate of farms according to various species of common carps

2 結 果

2.1 重點調查的“鯉急性爛鰓病”養殖場的CEV和KHV檢測結果

在河北、河南、遼寧、內蒙古自治區、北京等5個省市重點調查了26家正在發生或曾經發生過“鯉急性爛鰓病”的養殖場。22個正發病的養殖場中, 19個場檢測為CEV陽性、KHV陰性; 1個養殖場為CEV陰性、KHV陽性; 另2個養殖場CEV、KHV均為陰性, 其中1個養殖場病魚鰓絲上檢測到大量孢子蟲。4個曾發病的養殖場中, 1個檢測為CEV陽性、KHV陰性; 3個養殖場CEV、KHV均為陰性; 檢測結果詳見表1?？梢娊陙砗颖?、河南、遼寧、北京、內蒙古自治區等地區養殖的鯉或錦鯉暴發的“鯉急性爛鰓病”主要病因應為CEV感染, 還有少數病例為KHV感染或寄生蟲感染等其他原因。

在重點調查發生CEVD的養殖場中, 規格3—40 cm的鯉、2—25 cm的錦鯉均會發病, 發病場養殖魚類的死亡率多數在20%—50%, 個別養殖場死亡率60%以上。發生高死亡率的養殖場均是在發病過程中采取了濫用藥物、大換水等刺激性措施。

2.2 CEV流行學監測特點

養殖場CEV的陽性率：在9個省市的97家鯉和錦鯉養殖場中, 50家養殖場檢測結果為CEV陽性,陽性率52%。

地區分布：監測的黑龍江、遼寧、河南等9個省市的鯉和錦鯉養殖場, 都檢出了CEV陽性。其中河南養殖場的CEV陽性率最高, 為68%, 隨后是遼寧60%和北京55%。山西和陜西養殖場的CEV陽性率相對較低, 均為20% (表2)。將不同省市來源的CEV陽性養殖場的檢出率進行方差分析, 結果地區對CEV的檢出率的影響無顯著差異(P＞0.05)。將中東部地區(黑龍江、遼寧、北京和河南)的CEV陽性養殖場的檢出率與西部(內蒙古自治區、山西、陜西、寧夏回族自治區和新疆維吾爾自治區)的檢出率進行方差分析, 結果它們之間也無顯著差異(P＞0.05)。以上結果表明CEV至少已經在這9個省市的鯉和錦鯉養殖場中流行, 并且CEV的流行地區之間檢出率無顯著差異。

水溫分布：監測的97家鯉和錦鯉養殖場中, 采樣時水溫在12—20℃的養殖場16家, 6家CEV檢測為陽性, 陽性率38%; 采樣時水溫在20—27℃的養殖場81家, 44家CEV檢測為陽性, 陽性率54%; 即CEV的感染水溫至少包括12—27℃ (表3)。采樣水溫在20—27℃組的CEV的陽性率高于水溫在12—20℃組, 但方差分析2組之間無顯著差異(P＞0.05), 提示在一定溫度范圍內, 水溫對鯉和錦鯉的CEV檢出率影響不顯著。

規格分布：監測的97家鯉和錦鯉養殖場中, 樣品魚規格在1—12 cm的養殖場57家, 31家CEV檢測為陽性, 陽性率54%; 樣品魚規格在12—30 cm的養殖場40家, 19家CEV檢測為陽性, 陽性率48%; 即CEV感染魚的規格至少包含體長1—30 cm (表4)。樣品魚規格1—12 cm組養殖場的CEV陽性檢出率略高于樣品魚規格12—30 cm組, 但方差分析結果表明兩組之間無顯著差異(P＞0.05), 提示我們規格對鯉和錦鯉的CEV感染率無顯著影響。

品種分布：監測的97家鯉和錦鯉養殖場中,40家錦鯉養殖場, 24家CEV陽性, 陽性率60%; 57家鯉養殖場, 26家CEV陽性, 陽性率46% (表5)。錦鯉養殖場的CEV檢出率高于鯉養殖場, 但方法分析表明兩者之間無顯著差異(P＞0.05), 提示鯉和錦鯉的CEV感染率無顯著差異。

流行的基因型：獲得的北京、遼寧、河南等地的8個CEV毒株p4a基因部分序列, 構建無根進化樹(圖1)。分析表明, 8個序列均屬于GenogroupⅡa型。其中河南毒株20170518-2、20170913-1和遼寧毒株20170706-1、20170706-2、20170706-3與英國毒株R083、P054 1.3和日本毒株CyPP-3關系較近。北京毒株20170505-1與英國毒株Q098、M141、R082 1.4、R004 1.2及波蘭毒株687—2014、274—2014、518—2014關系較近。

3 討 論

調查發現早在2003年河南等地就零星出現“鯉急性爛鰓病”病例, 2007—2013年病例逐年增多, 此后不同年份嚴重程度不一[2]。該病一般發生在5—7月及9月, 發病時間持續7—10d, 僅鯉和錦鯉發病。病魚出現頭部凹陷、發黑, 鰓絲發黑腫脹或爛鰓, 凹眼, 昏睡等癥狀。該病的發病特點和癥狀與已報道的KHVD和CEVD的特征最相符(表6); 但也可能是細菌性爛鰓病、寄生蟲病或其他疾病。然而養殖者采用殺蟲藥、抗菌藥、消毒藥、換水等方式無法防治該病, 送檢的病魚也多數檢測不到柱狀黃桿菌和/或某種大量寄生蟲, 因此基本可以排除后者。CEVD在我國確診比KHVD晚十多年, 一直未被懷疑, 直到2016年CEVD在我國確診[6—8], 開始懷疑CEV可能與該病有關。徐立蒲等[9]對河南暴發 “鯉急性爛鰓病” 的養殖場調查, 認為主要病因應為CEV感染。本研究在河北、河南、遼寧、北京、內蒙古自治區等5省市26家疑似發生“鯉急性爛鰓病”的養殖場調查, 發現CEV陽性率高達77%,而KHV僅為4%, 確認CEV感染是目前“鯉急性爛鰓病”的主要病因。

CEV和KHV均為DNA病毒, 均可感染鯉和錦鯉, 并引起爛鰓、凹眼等相似的癥狀。但二者也存在一些差異, 2種病發病水溫有不同, 前者發病水溫范圍較廣, 在7—27℃都有發病, 而后者發病水溫在16—30℃。在發病魚上多次觀察到感染CEV的魚鰓絲有腫脹現象, 鰓絲有時呈黑色, 剪破后流出的血液迅速凝結; 有昏睡癥狀, 發病小魚還出現魚體浮腫癥狀[14]; 而感染KHV的魚還未見此類癥狀報道[18]。

20世紀70年代CEV首先在日本報道[19], 之后很長一段時間僅在日本流行。1999年以后, 美國、歐洲多國、印度、巴西、中國等陸續從發病的錦鯉和鯉上檢出[6—8,13,14,20—26]。2013—2015年, Matras等[13]監測了波蘭的36個鯉和錦鯉場, 17個CEV陽性場,陽性率達47%。本次的CEV隨機監測發現, 監測的9省市中CEV陽性養殖場的比率從20%—68%不等,總體上CEV陽性養殖場的比率高達52%, 這與波蘭情況相似。而影響鯉和錦鯉養殖的另外2種重要的病毒KHV和SVCV, 我國2016年專項監測顯示陽性養殖場比率僅分別為1.8%和9.3%[27], 都遠低于CEV的檢出率。結合CEV感染是“鯉急性爛鰓病”的主要病因的結果, 提示CEV已成為對我國鯉和錦鯉養殖業危害最嚴重的病原。

圖1 基于CEV p4a基因部分序列構建的無根進化樹Fig. 1 Unrooted phylogenetic tree based on partial p4a gene sequence of CEV

表6 CEV與鯉皰疹病毒的信息比較Tab. 6 Comparing biological information among Cyprinid herpesvirus infected by CEV

據報道CEV的感染水溫為7—27℃[10]。本文檢出CEV的采樣水溫分布在12—27℃, 由于水溫12℃以下和27℃以上未采集樣品, 還無法確定這些水溫下我國養殖場是否存在CEV感染情況。將樣品按采集溫度以20℃為分界限劃分的兩組之間在CEV檢出率上并沒有顯著差異, 這表明在一定溫度范圍內, CEV并沒有最適宜的感染水溫; 在進行CEV監測時, 水溫不是影響檢出率的主要因素。這與SVCV檢出水溫集中在11—17℃[28]和KHV檢出水溫主要在16—28℃[27]明顯不同(表6)。調查和監測發現各規格的鯉或錦鯉均可感染CEV, 且沒有對特定鯉品種或特定規格魚感染的選擇性, 這與國外報道的觀點一致[13,20—26]。2013年, 英國Way等[25]根據CEV病毒的p4a基因部分序列將CEV基因型劃分為Genogroup Ⅰ型和GenogroupⅡ型, 其中Ⅰ型毒株僅感染鯉, Ⅱ型毒株感染鯉和錦鯉。2016年, Matras等[13]按此基因, 發現Ⅱ型又可分為Ⅱa型和Ⅱb型, 其中Ⅱa型毒株感染鯉和錦鯉, Ⅱb型毒株感染鯉。本次調查檢出的8株CEV屬于Ⅱa型, 我國浙江、云南檢出的CEV也屬于Ⅱa[8,29], 提示目前我國CEV流行的主要基因型為GenogroupⅡa型。

對發生CEVD的養殖場重點調查結果表明, 發生CEVD前普遍存在換水、倒池、水質突變、天氣突變、魚藥使用等情況, 這些情況會使養殖魚產生應激, 而魚感染病毒后體質下降遭遇應激后易發病。有的養殖場在發病后濫用各種魚藥, 結果導致鯉更大規模死亡; 在發病后用藥少的養殖場反而鯉死亡率較低。國外的研究也表明, 應激是養殖的鯉發生CEVD的主要誘因[30]。因此養殖場要提高養殖管理水平, 在發病前后避免濫用藥等能導致魚體產生應激反應的情況, 是防控CEVD和降低損失的有效措施。

致謝:

感謝河南省、河北省、遼寧省、內蒙古自治區、陜西省、新疆維吾爾自治區、黑龍江省、寧夏回族自治區、山西省等水產技術推廣站在調查時給予的大力支持; 感謝江育林研究員對全文進行的審閱與修改。