可得然膠生產菌種的篩選及發酵條件優化

王蕭玉竹 ， 董晉軍 ， 許國超 ， 韓瑞枝 ， 倪 曄 *

（1.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

可得然膠是一種由D-葡萄糖以β-1，3糖苷鍵連接組成的無支鏈的胞外多聚糖[1]。產可得然膠的菌株主要是糞產堿桿菌（Alcaligenes faecalis），也有少量三葉草根瘤菌屬（Rhizobium trifolii）[2]、放射土壤桿菌（Agrobacterium radiobacter）[3]等其他菌種生產可得然膠的報道?？傻萌荒z不溶于水、乙醇，易溶于堿液，二甲基亞砜，具有獨特的熱凝性質，當被加熱至55℃時，可形成低固型凝膠，繼續加熱至80℃以上，可以形成有較高強度和彈性的高固型凝膠[4-5]。由于這一特殊性質，使得可得然膠在食品方面有著極其廣泛的應用，可以作為食品增稠劑、結構改良劑應用于果凍、面條、可食用纖維以及新型減肥保健食品[6]。近年來，隨著對可得然膠性質的深入挖掘，可得然膠在醫藥方面的作用也日益凸顯。研究發現，可得然膠可以作為藥物傳遞的載體，其硫化、胺化衍生物具有免疫學功效，可用于腫瘤治療等[7-8]?？傻萌荒z是繼黃原膠、結冷膠之后第3個被美國FDA批準的由微生物發酵生產的可食用多糖，我國衛生部也于2006年正式批準該凝膠在部分食品中應用。作者從土壤中篩選到一株可以生產可得然膠的根瘤菌（Rhizobiumsp.CGMCC 12099），并對該菌產可得然膠的發酵培養基進行優化以提高其凝膠產量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 菌株：江蘇省無錫市龍寺生態園土壤中篩選獲得，經鑒定為根瘤菌屬（Rhizobiumsp.），中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏號為CGMCC 12099。

1.1.2 培養基 苯胺藍篩選培養基（g/L）：蔗糖20，酵母粉5，蛋白胨5，瓊脂粉20，苯胺藍0.05，pH 7.0，121 ℃滅菌 20 min；種子培養基（g/L）：葡萄糖20，酵母粉 5，蛋白胨 5，pH 7.0，121 ℃滅菌 20 min；發酵培養基 （g/L）： 葡萄糖 20，（NH4）2HPO41.5，KH2PO41.0，MgSO40.25，FeSO4·7H2O 0.05，MnSO40.02，CoCl2·6H2O 0.01，ZnCl20.01，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.2 菌株的篩選

1.2.1 初篩 篩選所用的土壤樣品分別采集于江蘇省無錫市濱湖區大浮鎮龍寺生態園的草叢、湖邊潮濕土壤、樹林茂密的山地土壤。將采集到的不同土壤樣品分別加入到生理鹽水中，梯度稀釋后涂布于苯胺藍篩選平板，30℃靜置培養2 d，待菌落長出，挑選平板上呈深藍色的菌株再次在苯胺藍平板上劃線純化，挑選始終保持深藍色的單菌落接入30 mL種子培養基中，30℃，120 r/min，培養10 h。

1.2.2 復篩 將3 mL初篩后的種子菌液接入30 mL發酵培養基中，30℃，120 r/min培養60 h，對凝膠產品進行提取及鑒定。

1.2.3 菌種鑒定 提取菌株的基因組，采用細菌16S rRNA通用引物進行PCR擴增，擴增產物經測序分析（由上海生工生物技術服務公司完成），得到的測序結果在 NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）數據庫中進行BLAST比對，比較分析與其他菌株的同源性，并結合菌株的形態學特征，對菌株進行分類鑒定[9]。

1.3 產物提取及鑒定

1.3.1 產物提取 取5 mL發酵液于6 000 r/min離心10 min，棄上清液，向沉淀中加入10 mL 0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液并振蕩混勻1 h，使得凝膠產品完全溶解在氫氧化鈉溶液中，再次6 000 r/min離心10 min。將上清液用2 mol/L鹽酸中和至pH 6.5～7.0，析出的凝膠和離心后的細胞沉淀分別用去離子水洗滌3次，80℃烘干至恒重。

1.3.2 熱凝性鑒定及膠強測定 取凍干的凝膠產品0.2 g溶于10 mL去離子水中，充分勻漿后放入18 mm×180 mm的玻璃試管中，沸水浴10 min，然后在冷水中冷卻30 min，觀察凝膠是否具有熱凝性。凝膠強度測定參考食品安全國家標準[10]。

1.3.3 凝膠產物組分鑒定及紅外圖譜鑒定 將0.1 g凝膠產物的凍干粉與10 mL 1 mol/L的硫酸溶液混合，首先在120℃下水解1 h，后將水解液離心取上清，進行第二部水解，條件同第一次。將兩步水解后的凝膠水解液用過量硫酸鋇中和，再離心取上清液。凝膠水解液的組成成分通過液相色譜檢測，所用儀器是 Agilent 1260 Infinity HPLC system（CA，USA），流動相為水相，流量0.5 mL/min，柱溫65℃，進樣量10 μL。紅外光譜由傅立葉紅外光譜儀FT/IR-IS10 Nicolet （Thermo，MA，USA） 進行檢測，采用溴化鉀壓片法[11]，所用的商品可得然膠購買自Sigma公司。

1.3.4 凝膠產物相對分子質量鑒定 凝膠產物的相對分子質量（Mw）檢測采用高效凝膠色譜層析技術，所用的儀器為高效液相儀（Waters 501，Miliford，MA）， 分離凝膠柱 （Superose 12，10 mm ×300 mm，Pharmacia Inc.）?？傻萌荒z樣品溶于0.5 mol/L氫氧化鈉水溶液中，流動相為0.5 mol/L氫氧化鈉，流量為1 mL/min，進樣量為20 μL。實驗中所用的所有葡聚糖標準品均購自Sigma公司。

1.4 分析方法

1.4.1 葡萄糖檢測 發酵液中的葡萄糖殘糖檢測采用DNS法[12]。

1.4.2 銨根離子檢測 發酵液中的銨根離子檢測采用次氯酸-水楊酸鈉法[13]。

1.4.3 凝膠產量及細胞量 凝膠產量及細胞量檢測通過計算單位體積發酵液中凝膠的干質量和細胞干質量，方法同1.3.1。

1.4.4 糖轉化率計算 單位體積發酵液產膠量（g/L）與消耗的葡萄糖質量濃度（g/L）之比即為糖轉化率。

1.5 產可得然膠的搖瓶培養基優化

將保存于甘油管中的菌株在平板上劃線活化，然后將單菌落接種于30 mL種子培養基，于30℃，120 r/min培養18 h，然后以體積分數10%的接種量接種于60 mL發酵培養基，相同條件下培養60 h。所有培養基優化都是基于材料方法中的發酵培養基成分。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選及鑒定

可得然膠是一種僅由β-1，3糖苷鍵連接而成的葡聚糖，而β-1，3糖苷鍵可以和苯胺藍試劑特異性結合而顯藍色[3]，因此苯胺藍篩選方法被廣泛用于可得然膠生產菌株的篩選中[14-15]。通過苯胺藍法對土樣進行篩選，從平板上挑選顯深藍色的菌株，然后進行搖瓶復篩，根據已報道的可得然膠提取方法進行產物提取和初步鑒定，最終從87株候選菌株中篩選到一株可以產可得然膠的菌株，該菌株在苯胺藍平板上顯藍色（圖1），在固體種子培養基平板上30℃培養72 h后，菌落呈淺黃色，表面凸起且濕潤。細胞的革蘭氏染色為陰性，在光學顯微鏡下觀察呈短桿狀，無芽孢，無鞭毛，圖2為該菌株經過結晶紫染色的細胞在光學顯微鏡下的顯微形態圖。

采用通用引物擴增篩選菌株的16S rDNA片段，經測序其長度為1 382 bp，在NCBI數據庫中比對顯示，該菌株與Rhizobium radiobacter的同源性最高，達到99%。選取與目的菌種同源性較高的5株菌，用MEGS 5.0軟件建立系統菌株進化樹，結果如圖3所示，鑒定菌株與根瘤菌屬均有最高的同源性，并且與Rhizobium radiobacter進化親緣關系最近，結果與16S rRNA的序列比對結果一致，進一步說明該菌株屬于根瘤菌屬。依據菌株菌落形態和16S rDNA序列鑒定，該菌株被鑒定為根瘤菌屬（Rhizobiumsp.），并保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心（保藏號：CGMCC 12099）。

圖1 菌株CGMCC 12099在苯胺藍平板上的菌落形態Fig.1 Colonies of Rhizobium sp.CGMCC 12099 on aniline blue plate

圖2 菌株CGMCC 12099光學顯微鏡形態圖Fig.2 Observation of stain Rhizobium sp.CGMCC 12099 with optical microscope

圖3 篩選菌株（Rhizobium sp.CGMCC 12099）的系統進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree of Rhizobium sp.CGMCC 12099

2.2 培養基優化

2.2.1 葡萄糖質量濃度對凝膠的影響 葡萄糖是合成可得然膠的重要前體物質，對培養基中葡萄糖的濃度進行優化，結果如圖4所示。隨著培養基中葡萄糖質量濃度的增加，可得然膠的產量先增加后下降。在葡萄糖質量濃度為40 g/L時，可得然膠產量最高達到13.8 g/L。在三角瓶中對不同初始葡萄糖質量濃度下的可得然膠發酵結果進行分析可知（見圖5），在葡萄糖初質量濃度為40 g/L培養基中，菌體經過8 h左右進入穩定期，而在糖質量濃度為100 g/L的培養基中，菌體在20 h左右才達到生長穩定期，且最終菌濃（1.12 g/L）僅為在40 g/L糖質量濃度下的63.5%。在40 g/L初始葡萄糖質量濃度的培養基中，葡萄糖平均消耗速率為0.73 g/L/h，是高初始糖質量濃度（100 g/L）的1.87倍，說明較高的初糖質量濃度對菌體的生長有一定抑制作用。由圖5可知凝膠的快速合成在菌體生長進入穩定期之后，由于初糖質量濃度較高對菌體生長的抑制作用，使得菌體進入穩定期時間延長，進而導致凝膠開始合成時間延后，在100 g/L的初始葡萄糖質量濃度下凝膠合成較40 g/L的初始葡萄糖質量濃度下延后10 h左右。從圖中還可以發現，穩定時期的菌體濃度對產膠量有較大影響，100 g/L的初始葡萄糖質量濃度遠低于40 g/L的初始葡萄糖質量濃度下發酵產生的凝膠量，最終凝膠產量僅為40 g/L糖質量濃度下的57.9%。綜上，高初始葡萄糖質量濃度不利于Rhizobiumsp.CGMCC 12099的生長和可得然膠的搖瓶發酵。發酵培養基中葡萄糖質量濃度應控制在40 g/L左右。

圖4 發酵培養基中的葡萄糖質量濃度對可得然膠產量和糖轉化率的影響Fig.4 Effect of initial glucose on curdlan production and glucose conversion rate by Rhizobium sp.CGMCC 12099

2.2.2 氮源的確定及濃度影響 考察了以牛肉浸膏，酵母粉，（NH4）2HPO4，NH4Cl作為唯一氮源時的凝膠合成情況，如圖6（a）所示。結果表明，無機氮源較有機氮源更有利于凝膠的合成，以（NH4）2HPO4為氮源時凝膠產量較NH4Cl高，說明磷元素對凝膠的合成也有一定的促進作用?？傻萌荒z合成需要的前體物質尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-葡萄糖）是由尿苷三磷酸（UTP）與葡萄糖合成的[16]，磷元素對UTP的再生起到了重要作用。因此，（NH4）2HPO4的加入不僅為菌體生長提供氮源，還促進了可得然膠的合成，繼而對（NH4）2HPO4的添加量進行優化?？傻萌荒z是典型的次級代謝產物，在氮源限制性條件下開始合成，此后菌體量保持穩定[17]，如圖 6（b）所示，可得然膠的合成量隨著培養基中 （NH4）2HPO4質量濃度的增加呈現先增后減的變化。當（NH4）2HPO4質量濃度為1.5 g/L時，凝膠產量為14.2 g/L達到最高，此時糖轉化率（66.7%）也達到最高。

圖5 不同初始葡萄糖質量濃度下可得然膠搖瓶發酵時間進程曲線Fig.5 Time course of curdlan fermentation by Rhizobium sp.CGMCC 12099 under different initial glucose concentrations

2.2.3 無機鹽對凝膠產量的影響 無機鹽是菌體細胞生長代謝不可或缺的成分，考察了MgSO4和KH2PO4兩種無機鹽的影響，結果如圖7所示。MgSO4和KH2PO4在培養基中質量濃度對凝膠產量有較明顯地影響，鎂鹽質量濃度在1 g/L時為最佳。KH2PO4不僅為菌體生長代謝提供鉀元素和磷元素，磷酸二氫根還能在發酵液pH的緩沖和調節方面發揮一定的作用，單因素優化結果顯示KH2PO4的最佳質量濃度為1.5 g/L。

2.2.4 正交實驗優化結果 根據上述單因素實驗，設計4因素3水平的正交試驗。因素水平見表1，4因素分別為葡萄糖 （A），（NH4）2HPO4（B），KH2PO4（C），MgSO4（D）。 正交優化結果見表 2-3。

圖6 發酵培養基中不同氮源種類和添加量對可得然膠產量和糖轉化率的影響Fig.6 Effect of different nitrogen sources and amount of （NH4）2HPO4on curdlan production and glucose conversion rate by Rhizobium sp.CGMCC 12099

圖7 MgSO4和KH2PO4質量濃度對凝膠合成的影響Fig.7 Effects of MgSO4and KH2PO4on curdlan production and glucose conversion rate by Rhizobium sp.CGMCC 12099

表1 L9（34）正交實驗因素水平設計Table 1 Experimental variables and levels for orthogonal optimization experiment design

正交實驗結果極差分析和方差分析顯示，影響凝膠產量的主次順序：葡萄糖 >（NH4）2HPO4>KH2PO4>MgSO4，最優組合為：葡萄糖 50 g/L，（NH4）2HPO42 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO41.25 g/L。對得到的最優培養基方案進行搖瓶驗證，通過對可得然膠發酵過程中菌體質量濃度、可得然膠質量濃度和葡萄糖轉化率的監測，得到了可得然膠的發酵進程曲線，如圖8所示。經過3次重復試驗，可得然膠的平均產量為23.1 g/L，較優化前提高了29.2%，糖轉化率為62.6%，較優化前提高了5.4%，說明正交優化得出的工藝條件有效可行。

圖8 最優培養基條件下可得然膠搖瓶發酵進程曲線Fig.8 Time course of curdlan fermentation by Rhizobium sp.CGMCC 12099 in flasks

2.3 凝膠產物性質分析

根據可得然膠的理化特性，作者對凝膠產物的熱凝性、凝膠強度、分子組成和紅外光譜進行檢測。將20 g/L的凝膠產品懸濁液加熱后，產品形成了有彈性的膠狀固體，經過膠強檢測，該產品的凝膠強度為229 g/cm2。凝膠產品水解液經過液相分析顯示，該多聚糖僅由葡萄糖組成。利用凝膠色譜層析測得凝膠產品的平均相對分子質量為1.4×105，與文獻中報道的可得然膠相對分子質量5.3×104～2.0×106相符合[18]。通過對比紅外光譜圖可以發現，凝膠產品的紅外光譜圖與可得然膠商品的光譜圖一致。如圖9所示，圖中890 cm-1處有峰而在840 cm-1無峰，說明凝膠產物中僅有β-1，3糖苷鍵而沒有α型糖苷鍵[19]；3 410 cm-1和2 924 cm-1處的峰分別顯示樣品中的O—H基團和C—H基團；在1 075 cm-1處的峰是C—O基團的特征峰，與文獻中報道的紅外檢測圖譜一致[20]。

表2 正交實驗方案及結果分析Table 2 Design and results of orthogonal optimization experiment

表3 可得然膠產量方差分析Table 3 Variance analysis for curdlan production

圖9 凝膠產品與可得然膠商品的紅外光譜圖Fig.9 FT/IR spectra of the polysaccharide obtained in this study and the commercial curdlan sample

3 結 語

采用苯胺藍顯色平板篩選方法，從土壤中篩選到一株產可得然膠的根瘤菌（Rhizobiumsp.CGMCC 12099），并對該凝膠產品的理化性質進行了分析和鑒定?；趩我蛩貙嶒灲Y果，采用正交實驗的方法，對該菌株生產可得然膠的發酵培養基進行優化，確定產可得然膠的最優發酵培養基組成：葡萄糖50 g/L，（NH4）2HPO42 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO41.25 g/L，FeSO4·7H2O 0.05 g/L，MnSO40.02 g/L，CoCl2·6H2O 0.01 g/L，ZnCl20.01 g/L。對所得到的優化方案進行搖瓶發酵驗證結果顯示，優化后的可得然膠產量達到23.1 g/L，較優化前提高29.2%，糖轉化率為62.6%，較優化前提高了5.4%。