改性魔芋葡甘露聚糖對齊口裂腹魚脂質代謝及相關基因表達的影響

呂珍珍， 鄔應龍， 何 梅， 嚴秋萍， 陳明睿， 馮莉梅， 趙嘉琪， 王冰瑩

（四川農業大學 食品學院，四川 雅安 625014）

葡甘露聚糖廣泛存在于魔芋中，是一種不可消化的可溶性膳食纖維，但魔芋葡甘露聚糖在水中粘度大、溶解度低、流動性和溶膠穩定性差，使其應用受到限制。目前主要采用酶法、物理和酶酸結合的方法對葡甘露聚糖進行降解，提高其在水中的溶解度，擴大葡甘露聚糖的應用范圍[1]。

齊口裂腹魚是中國特有的重要冷水性經濟魚類，肉質鮮嫩，營養價值高。魚類營養性脂肪肝及腹腔脂肪過度蓄積的情況極易發生，這不僅會妨礙魚類的生長，甚至還可能引發魚類疾病，增加養殖成本[2]。對齊口裂腹魚脂質代謝方面的研究，主要集中在養殖中攝食蛋白質及脂肪含量等對魚肉品質及脂質代謝影響，有關不同改性魔芋葡甘露聚糖對齊口裂腹魚脂質代謝影響研究較少。

作者分別參考張遼[3]、高松[4]方法制備較低相對分子質量的酸解氧化魔芋和魔芋葡甘露聚糖硫酸酯，探討在飼料中添加不同劑量兩種不同改性方式的魔芋葡甘露聚糖對齊口裂腹魚生長、血液、基因等脂質代謝方面的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氧化魔芋葡甘露聚糖（OKGM）：四川農業大學食品學院功能性食品實驗室提供。

高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、總膽固醇（T-CHO）、甘油三酯（TG）試劑盒：南京建成生物工程研究所產品；瓊脂糖：Sigma公司產品；Golden view 染料、2×Taq PCR Master Mix、DEPC-H2O、Loading Buffer、 DL 2000 Marker：天根（Tian gen）試劑公司產品；SYBR 熒光定量試劑盒、cDNA反轉錄試劑盒均、RNA提取Trizol：Vazyme試劑公司產品。

1.2 主要儀器

Bio-Rad實時熒光定量PCR儀、Bio-Rad C1000普通 PCR儀、Bio-Rad電泳儀、Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數儀 （多功能酶標儀）、微量移液槍、ThermoFisher高速低溫離心機等。

1.3 實驗動物

從雅安市天全縣魚泉鄉購得420尾平均魚體質量為（80±1.21）g齊口裂腹魚，購買后于作者所在實驗室馴養15 d。

1.4 試驗設計與飼養管理

馴養結束后，按試驗設計將實驗動物分為7個組（每組3個重復，每個重復20尾），分別為對照組（基礎飼料）、質量分數 0.4%OKGMS、0.8%OKGMS、1.6%OKGMS、0.4%AOKGM、0.8%AOKGM 和 1.6%AOKGM。每天按每缸體質量2%投喂飼料，每日3次；早、晚對魚缸進行換水，并清除缸內不溶物。飼養期60 d（12 h白晝，12 h夜晚），24 h不間斷充氧，保持微流水。

1.5 生長性能指標測定

飼養60 d后，魚體饑餓24 h，從每缸中選取5尾魚稱量魚體質量，解剖后取出肝胰臟、背肌及腸道脂肪的質量，用預冷的無菌生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分，稱質量，置于-20℃冰箱，備用。測定魚的肥滿度，肝體比和腸脂比。

1.6 肌肉、肝臟基礎成分的測定

肝臟基礎成分測定參照食品安全國家標準GB 5009.3-2010 《食品中水分的測定》105℃直接干燥法、GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的測定》索氏抽提法、GB 5009.5-2010《食品中蛋白質的測定》凱氏定氮法進行測定。

1.7 樣品的采集和制備

稱重后，尾靜脈取血。將每尾魚的血液，4℃條件下靜置30 min待血液凝固后，于4℃條件下以3 000 g/min離心15 min，分離血清以用于血清中高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇、及甘油三酯的測定。測定方法參照試劑盒說明書方法進行。

每缸另取5尾魚取血后，解剖魚體，分別迅速取出肝胰臟，迅速置于液氮中冷凍，再轉入-80℃冰箱中保存，用于RNA提取。

1.8 肝臟脂質代謝相關基因定量分析

1.8.1 RNA提取 肝臟中RNA提取及純化參照TaKaRa試劑盒方法進行。

1.8.2 后續實驗為RT-PCR的cDNA合成 參照HiScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書進行操作。

將產物cDNA稀釋10倍保存于-20℃冰箱，用于后續熒光定量PCR反應。

1.8.3 脂質代謝相關引物 參照鄭俏然[4]等設計的齊口裂腹魚脂質代謝相關引物 β-actin，fas，lpl，hl，選用β-actin作為齊口裂腹魚內參基因 （引物設計見表 1）。

表1 實時定量PCR引物序列Table 1 Real-time quantitative PCR primer sequence

1.8.4 熒光定量PCR 參考Tian等[5]已報道的方法稍作修改，每個樣品3個平行。采用SYBR Green I熒光染料法，對 β-actin，fas，lpl，hl引物進行熒光定量分析：10 μL反應體系，含 5 μL SYBR? Premix Ex TaqTM （2×）、cDNA 1 μL、 上下游引物各 0.25 μL、DEPC 水 3.50 μL。 反應條件：95 ℃ 3 min；95 ℃10 s，相應退火溫度 30 s，39個循環后，進行95℃處理10 s；擴增完畢后，迅速降溫到65℃進行溶解曲線分析，然后以0.5℃/s的速率從65℃升溫到95℃，連續測定樣品熒光強度以獲取溶解曲線。

參考Livak等[6]數據分析方法：比較對照組和基礎組樣本數據，采用2-ΔΔCT相關定量進行計算。

1.9 數據處理

采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析，多重比較采用 Duncan’s檢驗法（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 OKGMS及AOKGM對齊口裂腹魚基礎生長指標的影響

與基礎相比，OKGMS及AOKGM各添加劑量對魚體體重、肥滿度均無顯著影響，當添加質量分數0.4%AOKGM時，顯著增加魚體的肝體比與腸脂比。

2.2 OKGMS及AOKGM對齊口裂腹魚肝臟基礎成分及血清生化指標的影響

與基礎組相比，在OKGMS改性條件下，肝臟脂肪質量分數均有所降低，其中質量分數1.6%OKGMS差異顯著；血清T-CHO質量分數均顯著降低；血清HDL-C、TG含量均有所增加，其中0.4%OKGMS及0.8%OKGMS差異顯著。與基礎組相比，在AOKGM改性條件下，肝臟水分質量分數有所降低，其中0.4%AOKGM及0.8%AOKGM差異顯著；肝臟脂肪、血清T-CHO均顯著降低；0.8%AOKGM及1.6%AOKGM顯著增加血清HDL-C及顯著降低血清TG質量分數。

2.3 OKGMS及AOKGM對肝臟相關基因q-PCR的影響

2.3.1 齊口裂腹魚lpl，hl，fasPCR擴增結果 以反轉錄肝臟cDNA為模板，進行PCR擴增，產物通過1 g/dL瓊脂糖凝膠檢測后發現，分別得到fas145 bp，lpl166 bp，hl268 bp目的產物，且條帶清晰明亮，滿足PCR分析要求。

圖1 齊口裂腹魚肝臟fas，lpl，hl pcr擴增結果Fig.1 Amplification results of fas，lpl，hl of Schizothorax prenanti

2.3.2 OKGMS 及 AOKGM 對肝臟lpl，hl，fas熒光定量的影響lplmRNA在肝臟中相對表達量見圖2。與基礎組相比，不同劑量OKGMS、質量分數0.4%AOKGM及1.6%AOKGM組肝臟中lplmRNA表達顯著增加，0.8%AOKGM組增加2.7倍。

圖2 lpl mRNA在肝臟中熒光定量PCR相對表達Fig.2 lpl mRNA Real-time quantitative PCR relative expression in the liver

hlmRNA在肝臟中相對表達量見圖3。與基礎組相比，不同劑量OKGMS及AOKGM，hlmRNA相對表達量沒有顯著差異。

圖3 hl mRNA在肝臟中熒光定量PCR相對表達Fig.3 hl mRNA Real-time quantitative PCR relative expression in the liver

fasmRNA在肝臟中相對表達量見圖4。與基礎組相比，1.6%AOKGM顯著增加了肝臟中fasmRNA相對表達量，其他各組沒有顯著差異。

圖4 fas mRNA在肝臟中熒光定量PCR相對表達Fig.4 fas mRNA Real-time quantitative PCR relative expression in the liver

3 討 論

肝臟是魚體脂類代謝的重要器官[7]，在魚體脂類消化、吸收、合成、分解等過程中起重要作用。

在陸地生物中發現，供給甘露寡糖（MOS）影響膽汁酸排泄、食糜上清液粘度或微生物方面變化影響腸脂質吸收，進而影響游離脂肪酸進入肝臟進行消耗[8]。然而在魚體方面，膳食纖維對脂質消化吸收的機制還不太清楚。肥滿度、肝體比、腸脂比反應魚體脂肪含量，過多脂肪在魚肉、肝胰臟及腸系膜等處積累，不僅造成魚肉品質差，魚體利用率下降影響魚體品質，且易形成脂肪肝造成病害。添加一定劑量OKGMS及AOKGM不會影響齊口裂腹魚生長效果，質量分數0.4%AOKGM顯著增加齊口裂腹魚肝體比、腸脂比。這與Mansour等[9]證實巨鱘魚攝食質量分數0.2%active MOS 46 d脂質質量分數增加，而攝食質量分數0.3%Immunoster 8周脂質不變結果一致。然而Ye JD等[10]研究證實牙鲆魚攝食質量分數0.5%Bio-MOS 56 d，降低了脂質沉積。這表明膳食纖維種類、飼喂時間、添加劑量等可能影響魚體脂質消化與生長。

在魚類脂肪合成和沉積過程中，lpl，hl，fas等發揮著重要作用。lpl和hl是調節機體脂肪沉積和脂質代謝的關鍵因子，fas是脂肪合成的關鍵酶，所以研究lpl，hl，fas基因表達量對研究魚類脂肪代謝至關重要[11]。脂肪合成分為兩個部分，第一部分：乙酰輔酶-A羧化酶通過碳酸氫鹽和ATP催化羧化乙酰輔酶-A形成丙二酰輔酶-A；第二部分：脂肪酸合成酶在NADPH條件下催化縮合乙酰輔酶-A和C2結構形成丙酰輔酶A，然后形成棕櫚酸[12]。fas在脂肪酸的從頭合成中發揮重要作用，它能催化乙酰輔-A和丙二酸單酰輔酶-A合成長鏈飽和脂肪酸，對動物脂肪沉積有著重要意義。OKGMS及AOKGM增加了肝臟中lplmRNA表達，當添加質量分數1.6%AOKGM fas表達顯著增加。Yokota等[13]證實了巖藻多糖對lpl基因表達的影響，其結果指出巖藻多糖能誘導脂肪細胞lpl基因表達，且其表達量隨著巖藻多糖劑量增多及作用時間延長而增加。目前關于多糖對水生動物hl，fas基因表達的影響研究還很少。夏曉杰等[7]證實大中小魚中lpl與fas表達成正相關關系，對肌間脂肪沉積有積極作用而hl作用不大。這表明OKGMS及AOKGM調控了lpl表達，在一定范圍內影響fas表達，且隨著膳食纖維種類及添加劑量不同表達不同。

脂肪在魚類細胞內主要以甘油三酯形式存在，甘油三酯是魚類脂類代謝的主要產物[14]。血漿中甘油三酯的含量是通過極低密度脂蛋白和乳糜微粒顆粒的合成與分解來調控。血液循環中是通過lpl和hl作用以及利用膽固醇酯酶轉移蛋白使內脂蛋白與甘油三酯進行置換來清除富含甘油三酯的脂蛋白[15]。OKGMS能顯著降低肝臟脂肪及血清膽固醇含量，增加血清高密度脂蛋白含量，當添加質量分數為1.6%OKGMS效果明顯；AOKGM顯著降低肝臟水分、脂肪及血清膽固醇、甘油三酯含量，增加血清高密度脂蛋白含量，當添加劑量為0.8%AOKGM效果明顯。與Fiordaliso等[15]研究低聚木糖和低聚果糖減少了肝臟脂肪生成，血液和肝臟膽固醇和甘油三酯水平，增加了血液中HDL/LDL比率結果一致。Lahoz等[16]證實在哺乳動物中hl作為高密度脂蛋白配體是一種脂肪分解酶，促進肝臟對它吸收。而且魚體中lpl和hl促進了肝臟對脂蛋白吸收，所以魚血清中高密度脂蛋白水平比其他脊椎動物高幾倍。Tian[5]等證實lpl表達增加，血清中高密度脂蛋白含量增加，甘油三酯含量降低。Delzenne等[17]證實較低肝臟脂肪可能與攝食中低聚木糖通過魚腸道微生物菌群發酵，生成葡萄糖激酶與結腸中短鏈脂肪酸。因此Campbell等[18]證實老鼠飲食中含有低聚木糖增加了盲腸中短鏈脂肪酸即醋酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽和乳酸鹽濃度。然而主要短鏈脂肪酸產物醋酸鹽和丙酸鹽對脂質代謝調制是相反的。醋酸鹽是脂肪生成的基質，丙酸鹽競爭性抑制醋酸鹽進入肝臟細胞。益生元被腸道微生物發酵的模式和肝臟醋酸鹽與丙酸鹽比例將決定其低脂肪性能，同時醋酸鹽與丙酸鹽比例因魚種類的不同而改變。由此推測添加一定劑量OKGMS或AOKGM，可能會增加食物體積，稀釋腸道內容物，促進有益菌乳酸菌、雙歧桿菌生長，產生短鏈脂肪酸并提高腸道短鏈脂肪酸濃度及比例，調控齊口裂腹魚肝臟中lpl表達，影響肝臟脂蛋白酯酶的活性，增加高密度脂蛋白含量促進高密度脂蛋白反向運輸膽固醇進入肝臟，加速膽固醇轉運與代謝，降低肝臟脂肪、血液中膽固醇和甘油三酯含量，增加高密度脂蛋白含量，調節魚體脂質代謝。

4 結 語

對比了兩種改性魔芋葡甘露聚糖對齊口裂腹魚脂質代謝及肝臟相關基因的表達，發現在OKGMS改性條件下，不同添加劑量降低齊口裂腹魚肝臟脂肪及血清膽固醇含量，顯著增加血清高密脂蛋白含量及肝臟lpl表達，且添加質量分數為1.6%效果更好。在AOKGM改性條件下不同添加劑量降低肝臟脂肪；對血清膽固醇、甘油三脂含量呈先降低后增加趨勢；增加血清高密脂蛋白含量及肝臟lpl表達，且添加質量分數為0.8%效果更好。