低溫反硝化細菌的篩選及初步應用

鄭雅元肖海燕 王祥河 許勤虎 劉 然

（天津市工業微生物研究所有限公司，天津 300457）

從廢水中去除氮是控制水污染、修復水質的最重要手段之一。隨著我國城市化進程加快、生產生活迅速發展，生活污水和工業廢水排放量日益增多，氮素的治理工作越來越受到重視。在廢水脫氮的眾多方法中，生物脫氮技術因其綠色環保、行之有效等特點受到廣大研究者的關注。生物脫氮是以反硝化細菌為主，在兼性厭氧條件下，將硝酸鹽及亞硝酸鹽作為電子受體進而生成氮氣的過程。

秋冬時節氣溫條件低，此時微生物生長活動受到抑制，導致生物脫氮效果不理想。有研究報道稱，當溫度條件在10℃以下時，硝化和反硝化進程會受到強烈抑制。目前國內外研究報道生物脫氮技術的溫度一般在30℃左右，涉及到低溫條件的研究比較少見。因此，從環境中分離篩選出能在較低溫度下生長、具有高效反硝化細菌菌株成為強化生物脫氮技術的關鍵。

1 材料與方法

1.1 材料

污泥樣品采自天津某污水處理廠；試驗用污水取自天津某調味料廠豆制品加工車間。

富集培養基：CH3COONa，2 g；KH2PO4，0.4 g；MgSO4·7H2O，0.6 g；CaCl·2H2O，0.07 g；KNO3，1 g；Tris緩沖液12mL；微量元素2mL；蒸餾水，1000mL；pH 7.0～7.2；121℃，滅菌 20min。

初篩培養基（BTB選擇性培養基）：KNO3，1 g；KH2PO4，1 g；FeCl2·6H2O，0.5 g；CaCl2·7H2O，0.2 g；MgSO4·7H2O，1 g；琥珀酸鈉，8.5 g；瓊脂，20 g；BTB（質量分數1.5%溴百里酚藍溶于無水乙醇），1mL；蒸餾水，1 000mL；pH 7.0；121℃，滅菌20min。

復篩培養基：乙酸鈉，4.72 g；KNO3，0.075 g；KH2PO4， 1.5 g； Na2HPO4， 0.42 g； MgSO4·7H2O，0.1 g；蒸餾水，1 000mL；pH 7.2；121℃，滅菌20min。

需氧性及運動性測定培養基：蛋白胨，10 g；酵母膏，5 g；葡萄糖，1 g；瓊脂，15 g；蒸餾水，1 000mL；pH自然；115℃，滅菌15min。

保藏培養基：可溶性淀粉，2 g；NH4Cl，0.5 g；NaCl，0.5 g；MgSO4·7H2O，0.01 g；FeSO4·7H2O，0.01 g；K2HPO4，0.2 g；蒸餾水，1 000 mL；pH 7.2；121℃，滅菌20min。

LB培養基：牛肉膏，3 g；蛋白胨，10 g；Na-Cl，5 g；蒸餾水，1 000mL；pH 7.2；瓊脂，20 g；121℃，滅菌20min。

1.2 微低溫反硝化細菌的富集培養

將污泥樣品混合均勻，稱取1 g置于500mL三角瓶中，加入400mL富集培養基，形成深層培養的缺氧環境，在22℃條件下慢速恒溫振蕩培養48 h，取培養液20mL至400mL新鮮富集培養基中，以2℃為梯度降低培養溫度，如此反復3次。

1.3 微低溫反硝化細菌的初篩、純化

將多次富集培養后的菌液進行梯度稀釋，涂布于初篩培養基（BTB選擇性培養基） 上，置于16℃培養箱培養2 d～3 d，選擇菌落周圍出現藍色暈環的單菌落，在新的BTB平板培養基上進行三區劃線，重復3～5次，獲得純化的反硝化菌株，涂布于LB培養基上無雜菌生長，接種于保藏培養基斜面上，編號，16℃培養1 d，4℃冰箱保存備用。

1.4 微低溫反硝化細菌生長曲線的測定

將保藏培養基斜面上的菌種用接種環挑取一環接入復篩液體培養基中，于20℃、120 r/min條件下振蕩培養5 d，每隔12 h測定各培養液的OD600值，制作各細菌的生長曲線。

1.5 微低溫反硝化細菌的復篩

分別將處于對數生長期的菌懸液轉接到復篩培養基中，以不接菌為對照組，于20℃、120 r/min條件下振蕩培養，每24 h分別測定實驗組和對照組復篩培養基中總氧化氮、總氮、細菌OD600及離心除菌后培養液中的總氮含量。

用以下公式計算總氧化氮和總氮的去除率：

式中：R——復篩培養基中總氮（總氧化氮）的去除率；

T1——復篩培養基中總氮（總氧化氮） 的初始質量濃度，mg/L；

T2——復篩培養基中總氮（總氧化氮） 的最終質量濃度，mg/L。

生物量氮通過氮平衡計算獲得，其公式為：

式中：T——生物量氮mg/L；

T2——反硝化培養基中總氮的終質量濃度，mg/L；

T3——通過離心去除菌體后培養液中總氮的終質量濃度，mg/L。

1.6 微低溫反硝化細菌的耐冷試驗

將處在對數生長期的mn-5菌株懸液轉接到新的復篩培養基中，于16℃條件下慢速振蕩培養3 d，檢測總氮的去除率。

1.7 革蘭氏染色

對mn-5菌株進行革蘭氏染色，確定其是屬于革蘭氏陰性菌（G-），還是革蘭氏陽性菌（G+）。

1.8 需氧性及運動性測定

將需氧性測定培養基分裝入試管，滅菌后取出冷至凝固，將試管倒置，用接種針蘸取少量菌苔，自固體深層培養基表面的中心點垂直穿刺，直到接近培養基底部，然后輕輕退出，保持接種線整齊。于20℃培養1 d，觀察細菌沿穿刺線的生長情況。

需氧性判定依據：專性好氧菌只生長在培養基表面；專性厭氧菌只生長在培養基底部；兼性厭氧菌生長在培養基表面及整個穿刺線；微好氧菌生長在培養基的中上部，約接近表面4mm處。運動能力判定依據：具有運動能力的細菌經穿刺培養后可沿著穿刺線向外運動生長，形成較粗的細菌生長線，且邊緣不整齊；不能運動的細菌僅能沿穿刺線生長，形成細而整齊的生長線。

1.9 污水處理的初步應用

把篩選出的mn-5菌株按接種量0.5 g/100g接入含污泥的豆制品加工廢水中，以不接種的廢水為空白對照，在16℃條件下培養5 d，測定廢水中的總氮含量。

1.10 試驗指標檢測方法

試驗采用的檢測方法見表1。

表1 試驗主要指標檢測方法一覽表

2 結果與討論

2.1 微低溫反硝化細菌的初篩

采用先富集、后選擇性培養的方法進行菌種的分離和純化，試驗中通過肉眼觀察，共挑選出10株菌株，經過平板劃線對比發現，菌株按其生長速度可大致分為三類。一類，1號、5號、7號、10號共4株菌，長勢旺盛，培養2 d～3 d即能長出顯著菌落，且易于轉移至斜面培養基保存；二類，2號、3號、4號、8號共4株菌，長勢較慢，培養5 d左右長出明顯菌落，盡管不如一類菌株長勢旺盛，但菌落特征顯著；三類，6號、9號共2支菌株，長勢較慢，培養7 d后尚見細微菌落出現。將各菌株分別編號為mn-1～mn-10，培養過程中觀察并記錄了各個菌株的形態特征，結果見表2。

2.2 微低溫反硝化細菌的復篩

當細菌處于對數生長期時，其個體形態與生理特性都比較穩定，因此將純化后的單菌落接于復篩培養基中，測定各菌株的OD600值，繪制生長曲線，以確定各菌株的對數生長期，結果如圖1所示。將純化后的10株菌株分別接種到復篩培養基中，以未接種的三角瓶為空白對照，進行篩選。通過測定濾液中硝態氮、亞硝態氮、總氮及離心去除菌體后的總氮濃度變化，從而確定各菌株的脫氮能力。培養3 d后各菌株對培養基中氮含量的降解情況如下頁表3所示。

圖1 10株反硝化菌株的生長曲線

表2 反硝化菌初篩菌株菌落形態表

由表3可以看出，培養3 d后，各組的硝態氮含量均出現了不同程度的降低，說明分離出的菌株普遍具有硝酸鹽還原能力。測定結果顯示硝態氮去除率大于50%的菌株有7株，其中mn-1和mn-5達到85%以上。然而隨著硝酸鹽的分解，亞硝酸鹽開始積累。硝態氮的去除表明了菌株還原硝酸鹽的能力，但亞硝態氮的累積，又說明某些菌株僅具有將NO3-初步還原為NO2-的能力，但無法進行或尚未進行進一步的還原反應，導致不能從反應體系中徹底脫氮。通過對比可以看出，菌株mn-1將硝態氮幾乎全部還原，但是還原產物大部分以亞硝態氮的形式存在，該菌株對亞硝態氮還原能力的缺失導致其總氧化氮去除率僅為3.6%。脫氮能力甚微。而菌株mn-5不僅硝態氮的去除率高，亞硝態氮的含量也沒有積累，表明對氮的去除比較完全，應具有完整的反硝化酶系，從而表現出了較強的脫氮能力。

通過氮平衡的方法計算出了菌體生長所合成的生物量氮含量，見表4。

表3 培養基中硝態氮和亞硝態氮的含量變化

表4 培養基中總氮的含量變化

由表4可以看出，培養3 d后，菌株mn-5的總氮去除率為48.5%，生物量氮合成量為3.25mg/L。

對篩選出的菌株mn-5進行鏡檢，菌體兩端鈍圓，確定為革蘭氏陰性短桿菌見圖2。

2.3 菌株mn-5的耐冷試驗

mn-5菌株在16℃條件下，3 d內總氮去除率為42.3%，與該菌在20℃條件下除氮相比效果有所下降，生物量氮的合成量也有所降低（3.01mg/L），可能是低溫使細菌生長速率減慢造成的。

圖2 菌株mn-5革蘭氏染色照片

2.4 菌株mn-5處理污水的初步應用

把菌株mn-5接入含污泥的豆制品加工廢水中，以不接種的廢水為空白對照，在16℃條件下培養5 d，測得廢水中的總氮含量變化結果見圖3。

圖3 菌株mn-5對污水中總氮的去除效果

由圖3可以看出，空白對照組總氮去除率為10.1%，試驗組的去除率為13.3%，提高了3%左右，與空白對照組相比其增長率為31.7%。在處理污水的實際應用中，菌種對總氮的去除率遠遠達不到篩選菌種時的40%以上，究其原因可能是由于篩選用培養基是以無機小分子成分為主，而豆類污水是以有機大分子為主，兩者在物質組成上有很大的不同，菌種對污水環境中的大分子有機物不適應導致，有待于進一步深入研究。