隱性聽力損失動物模型建立與防護的研究

戚國偉 劉宸箐 徐增志 劉晨 陳立偉 李歡 胡一勇 方舒 郭維維 于寧 楊仕明

1解放軍總醫院耳鼻咽喉頭頸外科，解放軍耳鼻喉研究所，聾病教育部重點實驗室（北京100853）

2解放軍醫學院（北京100853）3解放軍總醫院醫學美術室（北京100853）

隱性聽力損失（Hidden Hearing Loss,HHL）的概念由Liberman于2015年首次提出[1]?；加须[性聽力損失這類疾病的患者，純音測聽結果正常，但在處理復雜言語信息及時域編碼功能方面的能力缺失，尤其是在嘈雜環境中更加明顯，即表現為噪聲環境下的言語識別率下降。這種常規檢查手段無法檢出的、由聽神經損傷所引起的閾上聽覺感知缺失性疾病，叫做隱性聽力損失。目前關于隱性聽力損失的研究主要集中于兩個方面：一是發病機制的研究[2-3]，另一方面是臨床診斷方法的研究[4]。這其中，關于隱性聽力損失動物模型建立的研究更加有限，且不同課題組所用噪聲聲源、強度及暴露時間等條件均存在一定差異，尚未形成公認、可靠的動物模型建立標準。另外，幾乎所有文獻報道的噪聲均為穩態噪聲。為模擬槍械、火炮射擊等所引起噪聲損傷，本文采用脈沖噪聲暴露豚鼠，摸索建立隱性聽力損失動物模型的噪聲條件及損傷機制。同時，實驗中還利用吸入氫氣的方法對動物進行噪聲暴露前的預處理，為研究隱性聽力損失防護提供直接的實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

選取SPF級健康白色紅目、耳廓反射靈敏、無噪聲接觸史的豚鼠16只，體重250-300g，雌雄不限，購自北京金牧洋實驗動物有限公司。正常豚鼠聽性腦干誘發電位（Auditory Brainstem Response，ABR）閾值為18.82±4.52 dB SPL[5]，參照此標準，實驗前對所有豚鼠進行ABR閾值測定，確保聽力正常。所有豚鼠均飼養在環境為恒溫（20-26℃）、恒濕（45%-50%）條件下的超凈層流架中，使用Norsonic 140型聲級計監測環境噪聲，確保環境噪聲維持在40dB SPL以下。

實驗動物隨機分為4組，分別為：空白組（A組）3只、脈沖噪聲暴露30次組（B組）3只、脈沖噪聲暴露15次組（C組）5只、氫氣預防+脈沖噪聲暴露15次組（D組）5只，設置兩個ABR測聽記錄點：脈沖噪聲暴露前、脈沖噪聲暴露后1天（P1）。所有實驗操作均得到中國人民解放軍總醫院動物倫理委員會批準。

1.2 脈沖噪聲暴露

將清醒狀態的豚鼠放置于特制的籠內，將其頭部固定于正中，且脈沖噪聲暴露過程中不會轉動，確保雙耳同等的接受脈沖噪聲刺激。在專用的消聲室自由聲場中，將特制的脈沖噪聲激發裝置置于動物頭部前方水平位，距離豚鼠雙耳耳廓前緣約5cm（見圖1-A）。給予壓力峰值為163 dB SPL，脈寬為0.25ms，間隔時間為6.5s的脈沖噪聲，分別連續暴露30次及15次。為排除脈沖噪聲裝置自身物理特性改變所導致的實驗誤差，在每次噪聲暴露前均使用Norsonic 140型聲級計對裝置進行校準。

1.3 豚鼠聽性腦干反應（ABR）測定

動物麻醉：豚鼠使用1%戊巴比妥鈉（0.4ml/100g）腹腔注射進行麻醉。完全麻醉后，待其呼吸及心跳平穩，檢查清理雙側外耳道耵聹，并將動物置于保溫毯上。

ABR測定：采用美國TDT測聽設備和Biosig測聽分析軟件，在隔聲屏蔽室內進行測聽。使用銀針電極測試，記錄電極安置于豚鼠顱頂雙耳耳廓前緣連線中點處，參考電極置于測試耳耳垂下方，接地電極置于對側耳耳垂下方。測試耳機置于外耳道口約0.5cm，方向與外耳道走行方向平行，并確保未與毛發、耳廓等相接觸。刺激聲為短聲（click）,帶通濾波寬度為300-3000Hz，平均疊加次數1024次，刺激持續時程為10ms，最大刺激聲強度為90 dB SPL,每次降低幅值為10 dB SPL,直至無法引出可重復的ABR波形，再以5 dB幅度提高刺激聲強度，直至能引出可重復的ABR波形，并重復3次，其中至少有2次可引出確定的波形，此刺激聲強度即為動物的聽閾[6]。再以短純音（Tone Burst）16 kHz為刺激聲，刺激持續時間為4ms，上升和下降時間為0.5ms。

1.4 氫氣預防性治療

D組于脈沖噪聲暴露前2小時給予氫氣預防性治療，氫氣源由Healthgen AMS-H-01設備產生，通過自制的密封管路，將干燥后的氫氣導入特制容器中，待容器內氫氣濃度穩定在1000ppm后，將豚鼠放入容器內，持續吸入一小時，而后取出動物，一小時后進行脈沖噪聲暴露（豚鼠吸入氫氣的密封裝置見圖1-B）。

1.5 統計分析

所有實驗數據以均數±標準差()表示，實驗數據采用SPSS 22.0統計軟件包進行分析。先對數據進行正態性檢驗，為消除混雜因素對結果的影響，不同劑量脈沖噪聲暴露前后腦干誘發電位短聲閾值、短純音（16 kHz 70 dB SPL）Ⅰ波潛伏期、幅值進行比較利用自身配對t檢驗，脈沖噪聲暴露15次組與氫氣預防組采用兩兩配對t檢驗,P＜0.05具有顯著統計學差異。

2 結果

2.1 脈沖噪聲暴露前豚鼠聽力學指標

健康豚鼠ABR閾值測定結果曲線圖中包括5個典型的波峰，所用豚鼠ABR短聲閾值平均為21.33±3.20 dB SPL;短純音（Tone Burst，16kHz 70 dB SPL）聲強刺激下，其Ⅰ波潛伏期平均為1.57±0.1ms;幅值平均為0.46±0.08uv。Tone Burst（16 kHz 70 dB SPL）聲強刺激反應波形如圖1-C所示。

圖1 豚鼠聽性腦干反應（ABR）測定Fig.1 The auditory brainstem response of guinea pig(A)應用脈沖噪聲暴露裝置對豚鼠進行造模；（B）豚鼠吸入氫氣的密封裝置；（C）正常豚鼠Tone Burst 16kHz波形曲線（A）Guinea pig model of hidden hearing loss using a pulse electric spark detonation meter(B)Sealing device of inhaling hydrogen for guinea pig(C)ABR-Tone Burst 16kHz waves of healthy guinea pig

2.2 不同劑量脈沖噪聲暴露后豚鼠ABR短聲閾值變化情況

不同劑量的脈沖噪聲暴露1天后，B、C、D三組所有豚鼠的閾值均有不同程度的提升，與暴露前的閾值比較后，P值均小于0.05（各組脈沖噪聲暴露前后ABR閾值比較的統計量t值及P值見表一），表明三組豚鼠都產生了不同程度的聽力損失。其中脈沖噪聲暴露30次組的閾值平均提高36.67dB,暴露15次組的閾值平均提高21.25dB,氫氣預防加暴露15次組的閾值平均提高10.5dB（各組ABR閾值變化趨勢見圖2-A）?？梢钥闯?，脈沖噪聲暴露次數越多，閾值提升越明顯。

2.3 不同劑量脈沖噪聲暴露后豚鼠高頻反應Ⅰ波潛伏期、幅值變化情況

為了研究低劑量脈沖噪聲暴露是否能夠誘發豚鼠產生隱性聽力損失，我們特別測定了豚鼠高頻聽力的部分特定指標。結果顯示，不同劑量脈沖噪聲暴露后，各組豚鼠短純音（16kHz 70dB SPL）Ⅰ波潛伏期都有不同程度的延長。脈沖噪聲暴露前后自身對照的統計分析結果顯示，30次組（B組）的P值為0.61，變化不具有統計學意義；15次組（C、D組）的P值均小于0.05，前后變化具有統計學意義（各組脈沖噪聲暴露前后短純音Ⅰ波潛伏期比較的統計量t值及P值見表二）。相較于脈沖噪聲暴露30次，15次組的高頻反應Ⅰ波潛伏期均有所延長（各組脈沖噪聲暴露前后高頻反應Ⅰ波潛伏期變化趨勢見圖2-B）。

進一步分析低劑量脈沖噪聲暴露前后豚鼠短純音Ⅰ波幅值變化情況可見，不同劑量脈沖噪聲暴露后，各組豚鼠Ⅰ波幅值均有不同程度的降低。脈沖噪聲暴露前后自身對照的統計分析結果顯示，三組P值均小于0.05，表明各組變化均具有統計學意義（各組脈沖噪聲暴露前后短純音Ⅰ波幅值比較的統計量t值及P值見表三）。各組間對比可見，脈沖噪聲暴露15次組的幅值變化最為顯著。（各組脈沖噪聲暴露前后高頻反應Ⅰ波幅值變化趨勢見圖2-C）

2.4 氫氣防護作用在低強度脈沖噪聲暴露后的聽力學指標變化對比

在摸索建立隱性聽力損失豚鼠動物模型的條件過程中,我們額外添加了氫氣預處理因素,以期觀察氫氣對隱性聽力損失的預防作用。通過C、D兩組脈沖噪聲暴露后的聽力學指標統計分析，我們發現在脈沖噪聲暴露前吸入氫氣，其ABR的click閾值、短純音Ⅰ波幅值的P值都小于0.05，改變具有統計學意義；短純音（16kHz 70dB SPL）Ⅰ波潛伏期的P值為0.26，改變不具有統計學意義（C、D組各項聽力學指標比較的統計量t值及P值見表四）。

圖2 噪聲暴露前后各組豚鼠ABR指標變化趨勢Fig.1 Trends of guinea pig ABR result before and after impulse noise exposure

3 討論

目前針對隱性聽力損失的致病機制研究主要集中于兩個方面，一個是噪聲所引起的神經突觸病變[2]；一個是暫時性聽神經纖維脫髓鞘病變[3]。當前研究這兩種致病機制的動物模型主要應用豚鼠及小鼠展開，用于造模的噪聲源也都是穩態噪聲。應用脈沖噪聲作為噪聲源建立動物模型的研究報道較少，而將其應用于隱性聽力損失的研究中尚屬首次。當前，小型豬作為動物模型的基礎及臨床研究在耳科學界被廣泛應用[7]。侯琨[8]等利用寬頻帶白噪聲（120dB SPL）對小型豬和豚鼠進行單次3小時的暴露后發現，同噪聲暴露后即刻相比，豚鼠在噪聲暴露后24小時其ABR閾值就有明顯差異，由噪聲暴露所引起的聽力損失得到顯著恢復，7天后其閾值同暴露前相比無明顯統計學差異。相比之下，小型豬對噪聲更加敏感，噪聲暴露7天后其閾值同暴露前相比仍然存在明顯統計學差異，且耳蝸掃描電鏡下毛細胞形態學觀察也發現了更多的纖毛結構異常，相較小型豬，豚鼠對噪聲耐受力更強，且恢復更快。陳志婷[9]等利用聽性腦干反應分析觀察不同劑量脈沖噪聲暴露后小型豬的聽力變化發現，脈沖噪聲暴露30次、8周之后，小型豬的ABR閾值在各頻率上仍然存在不可逆的提升。因此，對于應用低劑量脈沖噪聲制作隱性聽力損失動物模型而言，豚鼠相較小型豬具有明顯優勢。

本實驗利用低強度脈沖噪聲暴露豚鼠進行隱性聽力損失的動物模型建立，通過暴露1天后的ABR閾值測定可見，30次及15次脈沖噪聲暴露的豚鼠閾值分別存在36.67dB和21.25dB的提升。Edward Lobarinas[10]等在動物實驗中發現，噪聲暴露24小時后ABR閾值產生約30dB暫時性域移（Temporary Threshold Shift，TTS）的大鼠，其毛細胞完整但突觸結構發生破壞，即發生隱性聽力損失。除此之外，所有隱性聽力損失大鼠的聽力學檢測結果還有一個共同特點:閾上刺激的ABRⅠ波幅值降低，且不可逆轉，這點可用于判斷實驗動物存在隱性聽力損失。

本實驗在測定ABR click閾值的同時，還進行了ABR（Tone Burst 16kHz 70dB SPL）Ⅰ波幅值、潛伏期的測定。相較于短音，短純音具有更好的頻率特異性，可以更加準確評估實驗動物某一特定頻率的聽力水平。Liberman[4]等人在研究隱性聽力損失診斷方法的實驗中發現，隱性聽力損失高危組人群的超高頻（8-20kHz）聽閾較正常組明顯提升,提示隱性聽力損失對高頻聽力存在較大影響，故本實驗中短純音選擇了16kHz作為刺激聲頻率。與此同時，豚鼠的聽性腦干反應中，其反應波波峰幅值、潛伏期與刺激聲強存在特殊的變化關系。當聲強在20-70dB范圍內提升時，其刺激波幅值提升較快，潛伏期縮短也較快；當刺激聲在80-90dB范圍內提升時，其刺激波幅值及潛伏期變化明顯變小，呈現出非線性關系，70dB為臨界值[5]。故本實驗短純音的刺激聲強選擇70dB。通過測試，我們觀察到正常豚鼠的ABR（Tone Burst 16kHz）Ⅰ波潛伏期為1.57±0.1ms，幅值為0.46±0.08uv。經過30及15次的脈沖噪聲暴露24h后，其潛伏期較脈沖噪聲暴露前分別產生了0.02ms和0.25ms的延長，其幅值較脈沖噪聲暴露前分別產生了0.14uv和0.19uv的降低。通過與脈沖噪聲暴露前的數據對比發現，C組（15次）的潛伏期和閾值都產生了具有統計學意義的變化。ABRⅠ波幅值代表螺旋神經元的總和電位活動[3]，通過幅值變化可以反映出螺旋神經元的結構與功能完整性。ABRⅠ波潛伏期同耳蝸內毛細胞與I型螺旋神經元之間形成的帶狀突觸功能有關，潛伏期的延長同帶狀突觸結構破壞密切相關。據此，根據脈沖噪聲暴露前后聽力學指標的變化，可以認定脈沖噪聲暴露15次后的豚鼠存在隱性聽力損失。

表1 脈沖噪聲暴露前后各組豚鼠ABR click閾值比較（±s，A、B組n=6,C、D組n=10,dB SPL,t檢驗）Table 1 Statistical analysis ofABR thresholds of guinea pig before and 24h after impulse noise exposure（±s，GroupAand Group B n=6，Group C and Group D n=10,dB SPL,t test

表1 脈沖噪聲暴露前后各組豚鼠ABR click閾值比較（±s，A、B組n=6,C、D組n=10,dB SPL,t檢驗）Table 1 Statistical analysis ofABR thresholds of guinea pig before and 24h after impulse noise exposure（±s，GroupAand Group B n=6，Group C and Group D n=10,dB SPL,t test

P＜0.05 means statistic difference

before noise 1 day later t p 21.33±3.20 NA NA NA 23.33±4.08 60±5.48 10.26＜0.001 19.38±1.77 40.63±5.63 10.32＜0.001 20.50±2.84 31.00±2.11 11.70＜0.001

表2 脈沖噪聲暴露前后各組豚鼠ABR Tone Burst 16kHzⅠ波潛伏期比較（±s，A、B組n=6,C、D組n=10,ms,t檢驗）Table 2 Statistical analysis ofABR Tone Burst 16kHzwaveⅠlatency of guinea pig before and 24h after impulse noise exposure（±s，GroupAand Group B n=6，Group C and Group D n=10,ms,t test）

表2 脈沖噪聲暴露前后各組豚鼠ABR Tone Burst 16kHzⅠ波潛伏期比較（±s，A、B組n=6,C、D組n=10,ms,t檢驗）Table 2 Statistical analysis ofABR Tone Burst 16kHzwaveⅠlatency of guinea pig before and 24h after impulse noise exposure（±s，GroupAand Group B n=6，Group C and Group D n=10,ms,t test）

P＜0.05 means statistic difference

A B C D before noise 1 day later t p 1.57±0.1 NA NA NA 1.62±0.05 1.64±0.05 0.55 0.61 1.53±0.05 1.78±0.09 10.88＜0.001 1.55±0.13 1.73±0.15 2.64 0.03

表3 脈沖噪聲暴露前后各組豚鼠ABR Tone Burst 16kHzⅠ波幅值比較（±s，A、B組n=6,C、D組n=10,uv,t檢驗）Table 3 Statistical analysis ofABR Tone Burst 16kHz waveⅠamplitude of guinea pig before and 24h after impulse noise exposure（±s，GroupAand Group B n=6，Group C and Group D n=10,uv,t test）

表3 脈沖噪聲暴露前后各組豚鼠ABR Tone Burst 16kHzⅠ波幅值比較（±s，A、B組n=6,C、D組n=10,uv,t檢驗）Table 3 Statistical analysis ofABR Tone Burst 16kHz waveⅠamplitude of guinea pig before and 24h after impulse noise exposure（±s，GroupAand Group B n=6，Group C and Group D n=10,uv,t test）

P＜0.05 means statistic difference

A B C D before noise 1 day later t p 0.46±0.08 NA NA NA 0.45±0.13 0.31±0.07-2.70 0.043 0.47±0.1 0.28±0.1-4.20 0.004 0.47±0.05 0.39±0.1-2.67 0.026

表4 吸入氫氣對豚鼠低劑量脈沖噪聲暴露防護效果的聽力學指標比較（±s，n=10,t檢驗）Table 4 Statistical analysis of auditory results of hydrogen on the protective effect of impulse noise exposure in guinea pig（±s，n=10,t test）

表4 吸入氫氣對豚鼠低劑量脈沖噪聲暴露防護效果的聽力學指標比較（±s，n=10,t檢驗）Table 4 Statistical analysis of auditory results of hydrogen on the protective effect of impulse noise exposure in guinea pig（±s，n=10,t test）

P＜0.05 means statistic difference

Group C Group D t p Click閾值40.63±5.63 31.00±2.11 5.35 0.001 TB16kⅠ波潛伏期1.78±0.09 1.73±0.15 1.23 0.26 TB16kⅠ波幅值0.28±0.1 0.39±0.1-2.53 0.039

在研究脈沖噪聲暴露次數與隱性聽力損失之間關系的同時，我們特別設定一組實驗動物（D組），在脈沖噪聲暴露1小時前給予預防性氫氣吸入，以觀察氫氣對脈沖噪聲所致隱性聽力損失是否存在預防作用。通過對比C、D兩組脈沖噪聲暴露后的聽力學數據發現，氫氣預處理組的豚鼠脈沖噪聲暴露24小時后其click閾值及Ⅰ波幅值較C組差異具有統計學意義。氫氣預處理組豚鼠脈沖噪聲暴露前后自身對照結果顯示，其聽力學指標也產生了具有統計學意義的差異，閾上刺激ABR的Ⅰ波幅值顯著下降，這與以往報道一致[11-14]。相較C組可以認為。D組豚鼠脈沖噪聲暴露后也產生了隱性聽力損失，且在聽力學表現方面吸入氫氣對隱性聽力損失存在防護作用。

本研究首次將脈沖噪聲運用到隱性聽力損失動物模型研究當中，通過對比不同次數脈沖噪聲暴露后豚鼠的聽力學指標變化，初步建立了脈沖噪聲暴露致豚鼠隱性聽力損失的動物模型。同時，利用吸入氫氣的方法對豚鼠進行噪聲暴露前的預處理，對氫氣在隱性聽力損失中的預防作用進行了初步探索，其相關分子機制及病理學變化需要進一步研究。