NLRP3炎性小體對冠心病患者血漿IL-1β、IL-18、TGF-β水平的影響*

胡龍江，周音頻△，曹運蘭，呂 湛，藍運競，寧 琳，向立權，肖 鵬

(1.重慶市涪陵中心醫院心血管內科 408000；2.貴州省人民醫院心血管內科，貴陽 550002；3.川北醫學院附屬醫院心血管內科，四川南充 637000)

隨著人民生活水平的不斷提高，心血管疾病的發病率逐年增加，特別是在發達國家及部分發展中國家。因此，進一步明確心血管疾病的發病機制及尋找新的心血管疾病防治策略迫在眉睫。有研究表明，局部和全身炎癥反應及自身免疫在心血管疾病發生發展過程中起著重要作用[1]。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3 (NLRP3)炎性小體是一種包含NLRP3、凋亡相關微粒蛋白(ASC)、半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)的蛋白質復合體,在機體正常免疫反應過程中起重要作用，是炎癥-免疫的橋梁，在心血管疾病中的作用是當前研究的熱點[2-3]，它能促進炎性因子白細胞介素(IL)-1β、IL-18的產生[4]，參與多種心血管疾病的發生發展，而當IL-1β、IL-18作為炎性因子參與機體炎癥反應，機體抗炎因子如TGF-β亦會發生相應變化。本研究通過檢測冠心病患者外周血單個核細胞(PBMCs)中NLRP3炎性小體的表達情況及血漿IL-1β、IL-18、轉化生長因子-β(TGF-β)的水平變化，進一步探討NLRP3炎性小體與冠心病發生發展的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2016年3-9月重慶市涪陵中心醫院健康體檢中心的健康體檢者30例(對照組)，心血管內科收治的冠心病患者60例(冠心病組)，年齡均在40～80歲，對照組肝、心、腎、肺檢查均正常，排除自身免疫性疾病、代謝性疾病、急慢性感染性疾病、近期創傷、腫瘤、正在使用抗炎藥物者，排除有遺傳病及傳染病家族史者。冠心病組符合患冠心病診斷依據(行冠狀動脈造影術證實)，排除移植血管病變者，排除嚴重心、肝、腎功能不全等慢性并發癥者，余排除標準同對照組。該研究獲重慶市涪陵中心醫院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1基本臨床資料采集 研究對象入組后，統計性別、年齡、吸煙史、平均動脈壓(MAP)、體質量指數(BMI)、空腹血糖(FPG)、血脂等臨床資料，所有研究對象入組后次日06:00時抽取外周靜脈血20 mL，取4 mL全血離心，抽取血漿，置于-80 ℃冰箱中備用，剩余全血，注入肝素抗凝管，Ficoll-Hypaque密度梯度分離出PBMCs。

1.2.2RNA提取及逆轉錄 采用RNAiso plus試劑盒提取人PBMCs總RNA，測定其濃度并檢測純度。利用PrimeScriptTMRT reagent Kit進行逆轉錄合成cDNA，引物序列由TaKaRa公司合成，見表1。

1.2.3RT-qPCR反應 應用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ熒光定量試劑盒進行實時定量PCR反應，反應體系及條件參照說明書，反應結束后，作擴增及溶解曲線，采用Ct值計算目的基因的相對表達量：ΔΔCt=(Ct病例組-CtGAPDH)-(Ct對照組-CtGAPDH)，病例組目的基因mRNA的相對表達量=2-ΔΔCt。

1.2.4Western blot 按照Western blot及IP細胞裂解液提取PBMCs總蛋白，并采用BCA法測定蛋白濃度。取40 μg蛋白進行8%SDS-PAGE凝膠電泳，裁膜，轉膜，BSA-TBS封閉液封閉4 h，浸入含蛋白NLRP3(1∶100)、ASC(1∶1 000)，caspase-1(2.5 μg/mL)、內參蛋白GAPDH(1∶500)的一抗稀釋液中，在 4 ℃孵育過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000)，在室溫孵育1 h，洗膜，凝膠成像分析系統顯影分析。

1.2.5ELISA檢測 應用ELISA法測定血漿IL-1β、IL-18、TGF-β水平，嚴格參照說明書進行操作。

2 結 果

2.1兩組基本資料及血脂、血糖水平比較 兩組性別、吸煙、年齡、BMI、FPG、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TCH)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、極低密度脂蛋白膽固醇(VLDLC)、差異無統計學意義(P>0.05)；MAP在冠心病組高于對照組，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)在對照組高于冠心病組(P<0.05)，見表2。

2.2兩組血漿IL-1β、IL-18、TGF-β水平變化比較 IL-1β、IL-18、TGF-β在冠心病組高于對照組(P<0.05)，見表3。

2.3兩組NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA水平比較 PBMCs中ASC mRNA在冠心病組中的表達高于對照組(P<0.05)，見圖1。

表1 引物序列

表2 兩組間基本情況及血脂、血糖水平變化比較

表3 兩組血漿IL-1β、IL-18、TGF-β水平變化比較

*：P<0.05，與對照組比較

圖1兩組NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA水平比較

2.4兩組NLRP3、ASC、caspase-1水平比較 PBMCs中NLRP3、ASC、caspase-1在冠心病組中的表達高于對照組(P<0.05)，見圖2、3。

*：P<0.05，與對照組比較

圖2兩組NLRP3、ASC、caspase-1蛋白水平比較

圖3 兩組Western blot檢測結果

2.5兩組NLRP3、ASC、caspase-1及其mRNA與其余各觀察指標相關分析 對照組caspase-1 mRNA與FPG呈正相關(r=0.394，P=0.031)，NLRP3與性別呈正相關(r=0.429，P=0.020)，ASC與FPG呈正相關(r=0.405，P=0.026)，caspase-1與MAP、FPG呈正相關(r=0.447、0.396，P=0.013、0.030)；冠心病組，NLRP3 mRNA和caspase-1 mRNA均與IL-18呈正相關(r=0.327、0.274，P=0.011、0.031)，ASC與年齡、IL-1β、IL-18呈正相關(r=0.370、0.467、0.403，P=0.024、0.009、0.027)；caspase-1與吸煙、IL-18呈正相關(r=0.613、0.414，P<0.01,P=0.023)。

2.6IL-1β、IL-18、TGF-β之間相關分析 Spearman相關分析顯示IL-1β、IL-18、TGF-β在對照組無相關性；而在冠心病組，IL-1β與TGF-β呈負相關(r=-0.287，P=0.026)。

3 討 論

動脈粥樣硬化是一種慢性、漸進性炎性疾病，炎癥反應在動脈粥樣硬化的發生、發展及粥樣斑塊的破裂、繼發性血栓的形成過程中發揮著重要作用。在冠心病患者中，粥樣硬化斑塊是貫穿于冠心病的關鍵點。同樣，炎性反應促進冠心病的發生發展及急性冠狀動脈綜合征的發生。NLRP3炎性小體具有調控機體慢性炎癥反應的功能，NLRP3 是其最核心的組成部分，包括中間的核苷酸寡聚結構域、C 端的亮氨酸重復序列及N 端的熱蛋白結構域，ASC是其銜接蛋白，與NLRP3 及caspase-1前體結合，并介導NLRP3激活caspase-1，而caspase-1 是其效應蛋白，它被激活后促使促炎因子如IL-1β和L-18的前體轉化為活性形式[4-5]。

IL-1β 是經典的炎性因子，參與動脈粥樣硬化相關的免疫與炎性反應，在冠心病的發生發展及斑塊的破裂過程中起著重要作用[6]，其機制包括：促進血管平滑肌細胞遷移及增殖[7]；促進血管內皮細胞增生及細胞外基質沉積；促進泡沫細胞形成；上調CD40 及其配體的表達[8]；促進免疫反應及免疫調節；促進動脈血栓形成。

IL-18是“多效能”炎性因子，在免疫及炎性反應過程中扮演著重要角色，它不僅通過誘導INF-γ的生成；誘導血管平滑肌細胞的增殖和遷移及血管內皮細胞的凋亡；促進泡沫細胞的形成；刺激血管壁細胞IL-1β、IL-8等細胞因子的表達；促進單核巨噬細胞基質金屬蛋白酶的表達及凋亡等機制促進冠心病的發生發展，而且增加動脈粥樣斑塊的不穩定性[9]，促進易損斑塊的形成，參與易損斑塊的潰瘍、破裂、血栓的形成[10]。IL-18是冠心病的獨立危險因子，并可對冠心病患者病情的發展及嚴重冠脈事件作出預測[11-12]。

TGF-β是具有多種生物學功能的多肽生長因子，在心血管系統中亦起重要作用。TGF-β具有抑制炎性反應的作用，而在動脈粥樣硬化疾病中，TGF-β在機體過度表達，其通過多種途徑使其對機體有利的生物學作用降低[13]，反而通過促進平滑肌細胞的增生、遷移、分化[14-15]；促進細胞外基質的合成與積聚，抑制細胞外基質的降解[13-14]；誘導血管重構[13-14]；促進血栓形成[14]；增加纖維帽厚度等機制促進冠心病的發生發展。

本課題組通過檢測PBMCs中NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA的表達，發現對照組PBMCs中ASC mRNA水平顯著低于冠心病組，提示NLRP3 炎性小體在患者病患者中部分組分在轉錄水平即表達增加，為冠心病患者激活NLRP3 炎性小體奠定了基本條件。雖然NLRP3 及caspase-1 mRNA的表達在冠心病患者中未見明顯增高，但均與IL-18呈正相關，提示NLRP3炎性小體在轉錄水平即有促進炎性因子IL-18表達的傾向。本課題組進一步提取PBMCs中總蛋白，并檢測NLRP3炎性小體各組分濃度，同時測定IL-1β、IL-18、TGF-β在血漿中的水平，發現冠心病患者中NLRP3、ASC、caspase-1濃度及血漿IL-1β、IL-18、TGF-β水平均高于對照組(P<0.05)，提示PBMCs中NLRP3炎性小體以及血漿IL-1β、IL-18、TGF-β水平與冠心病的發生發展密切相關；且ASC在冠心病組與年齡、IL-1β、IL-18呈正相關，caspase-1在冠心病組與吸煙、IL-18呈正相關，IL-1β在冠心病組與TGF-β呈負相關，提示在冠心病患者中，發揮正常免疫功能的NLRP3 炎性小體的調控失去平衡性，它被激活后，導致促炎細胞因子IL-1β 、IL-18 過量生成，繼而通過下游的信號轉導通路產生炎性瀑布反應，導致冠狀動脈炎性損傷。但在冠心病患者中，促炎因子IL-1β 和IL-18的表達并未直接促進抗炎因子TGF-β的表達，冠心病患者血漿TGF-β的高表達，與其他途徑密切相關，本課題組將進一步研究。

綜上所述，PBMCs中NLRP3炎性小體以及血漿IL-1β、IL-18、TGF-β水平與冠心病的發生發展密切相關，以NLRP3炎性小體為中心的NLRP3-ASC-caspase-1-IL-1β/IL-18信號通路可能在冠心病的發生發展過程中發揮重要作用，但該通路并未促進冠心病患者抗炎因子TGF-β的表達，血漿TGF-β高表達可能與其他途徑密切相關。因此，進一步研究NLRP3-ASC-caspase-1- IL-1β/IL-18信號通路以及TGF-β的激活及調控機制，進而針對該通路及TGF-β的干預有可能成為防治冠心病潛在而有效的策略。