丹酚酸B對氧化應激損傷乳鼠心肌細胞的保護作用及其機制

陳 雪，沈 楠，安 英，徐 博，趙麗晶

(吉林醫藥學院基礎醫學實驗中心，吉林 吉林132013)

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)的干燥根及根莖，是最常用的活血化瘀中藥之一，具有祛瘀止痛和養血安神的功效?，F代藥理研究[1-3]顯示：丹參具有擴張冠狀動脈、防治心肌缺血和心肌梗死、改善微循環及降低心肌耗氧量等作用，被廣泛應用于心血管系統疾病的治療。目前，已經從丹參中提取的化學成分主要包括脂溶性的二萜類醌類化合物和水溶性的酚酸類成分[4-6]。丹酚酸B是丹參的水溶性成分，是三分子丹參素與一分子咖啡酸縮合而成[7-9]，有關丹酚酸B的研究主要集中在其提取工藝和其對血管內皮細胞的保護作用[10-12]，而其對心肌細胞的影響未見報道。因此，本實驗采用過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)建立體外乳鼠心肌氧化應激損傷模型，觀察丹酚酸B對心肌細胞的保護作用并探討其相關機制，為丹酚酸B在保護心肌中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 Wistar乳鼠20只，清潔級，2 d齡，雌雄各半，購自吉林大學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(吉)2008-0005。丹酚酸B購自陜西森弗高科實業有限公司(批號20130903)，H2O2美國購自Sigma 公司(批號3135-1)，谷胱甘肽(glutathione, GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide Dismutase, SOD)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)試劑盒購自南京建成生物工程公司(批號20140428)，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)和肌酸激酶(creatine kinase, CK)ELISA試劑盒購自上海信然生物科技有限公司(批號20131125)。

1.2 乳鼠心肌細胞的原代培養及分組 乳鼠心肌細胞的培養方法參照文獻[7]。75% 乙醇常規消毒乳鼠，迅速分離心臟，并用組織剪將心肌徹底剪碎，加入約10倍心臟體積的0.125% 胰酶, 于37℃水浴、震蕩消化 5～7 min。向所得的消化液中加入等量的含20%新生牛血清的DMEM 培養液以終止胰酶作用。收集細胞懸液, 1 200 r·min-1離心5 min, 棄去上清, 細胞沉淀用含20% 血清的DMEM培養液重懸, 接種于培養瓶中, 用差速貼壁法去除成纖維細胞等非心肌細胞。心肌細胞懸液計數, 用含20%新生牛血清的DMEM 培養液稀釋至所需的細胞密度, 同時加入0.1 mmol·L-15-溴脫氧尿苷抑制成纖維細胞的生長, 接種到6孔培養板(細胞密度為每毫升3×105個細胞) 中, 于37℃、5%CO2條件培養。48 h后更換新鮮的含20%新生牛血清的DMEM培養液，72 h時, 培養的心肌細胞均伸出偽足, 且大部分已經匯合成片, 自主搏動良好。將原代培養的心肌細胞隨機分為正常對照組、模型組、低和高劑量丹酚酸B組，除正常對照組外，其余各組培養液中加入終濃度為100 μmoL·L-1的H2O2造成心肌細胞氧化損傷，低和高劑量丹酚酸B組同時分別加入終濃度為20和40 μmol·L-1丹酚酸B, 正常對照組加入等體積含20%新生牛血清的DMEM培養液，培養4 h后，光學顯微鏡下觀察細胞形態表現，并收集細胞和培養液上清，進行相關檢測。

1.3 倒置顯微鏡觀察心肌細胞形態表現 各組心肌細胞經相應處理后，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態學表現并拍照。

1.4 MTT法檢測心肌細胞存活率 各組心肌細胞經相應處理后，向各孔中加入100 μL MTT，繼續培養4 h，棄去培養液，加入400 μL DMSO溶液，震蕩10 min，采用酶標儀測定570 nm處吸光度(A)值，計算心肌細胞存活率。細胞存活率=(各組細胞A值/正常組細胞A值)×100%。

1.5 心肌細胞中GSH和MDA水平及SOD活性測定 各組細胞經相應處理后，用0.1%胰蛋白酶消化，1 000 r·min-1離心5 min收集細胞，嚴格按照試劑盒說明采用分光光度計測定GSH和MDA水平及SOD活性。

1.6 心肌細胞培養液中LDH和CK水平測定 收集各組細胞培養液，4 000 r·min-1離心10 min，小心吸取上清，嚴格按照試劑盒說明采用酶標儀測定上清中LDH和CK水平。

2 結 果

2.1 光鏡下各組心肌細胞形態表現和特征 與正常對照組比較，模型組心肌細胞部分懸浮在培養液中，貼壁細胞數量減少，心肌細胞偽足回縮，體積變小，心肌細胞自律搏動明顯緩慢。與模型組比較，低和高劑量丹酚酸B組心肌細胞數目明顯增多，偽足回縮少，自律搏動增強，其中高劑量丹酚酸B組對心肌形態改善程度優于低劑量丹酚酸B組。見圖1。

A: Control group; B: Model group; C: 20 μmol·L-1salvianolic acid B group; D: 40 μmol·L-1 salvianolic acid B group.

2.2 各組心肌細胞存活率 與正常對照組比較，模型組24和48 h心肌細胞存活率明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，高劑量丹酚酸B組心肌細胞存活率明顯升高(P<0.05或P<0.01)。見表1。

2.3 各組心肌細胞中GSH和MDA水平及SOD活性 與正常對照組比較，模型組心肌細胞中GSH水平明顯降低(P<0.01)，MDA水平明顯升高(P<0.01)，SOD活性降低(P<0.01)。與模型組比較，低和高劑量丹酚酸B組GSH水平升高(P<0.05或P<0.01)，而MDA水平降低(P<0.01)，SOD活性升高(P<0.05或P<0.01)。見表2。

2.4 各組心肌細胞培養液中LDH和CK水平 與正常對照組比較，模型組心肌細胞培養液中LDH和CK水平明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，低和高劑量丹酚酸B組心肌細胞培養液中LDH和CK水平均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表1 各組乳鼠心肌細胞存活率

Tab.1 Survival rates of cardiomyocytes of suckling rats in various groups (n=4,±s,η/%)

*P<0.01 compared with normal control group;△P<0.05,△△P<0.01 compared with model group.

表2 各組乳鼠心肌細胞中GSH和MDA水平及SOD活性

*P<0.01 compared with normal control group,△P<0.05，△△P<0.01 compared with model group.

表3 各組乳鼠心肌細胞培養液中LDH和CK水平

Tab.3 Levels of LDH and CK in culture medium of cardiomyocytes of suckling rats in various groups [n=4,±s,λB/(U·mL-1)]

*P<0.01 compared with normal control group;△P<0.05,△△P<0.01 compared with model group.

3 討 論

活性氧(reactive oxygen species,ROS)是細胞內多種氧化還原反應的代謝產物，其生成和清除處于動態平衡中。在各種損傷因素的作用下，ROS生成增多，出現氧化應激，ROS在體內增多并參與氧化生物大分子的形成，誘發基因突變、蛋白質變性和脂質過氧化，進而損傷溶酶體和線粒體等，最終導致細胞的氧化損傷[13-16]。氧化應激損傷在心肌缺血、心肌再灌注損傷及心力衰竭等病理變化中起到重要作用[17-19]。心肌細胞損傷過程中會出現脂質過氧化產物MDA水平升高以及GSH和SOD酶活性降低，同時會引起心肌細胞內LDH及CK釋放，引起血清內其水平的升高[20-21]，如何有效降低氧化應激對心肌細胞的損傷已成為心血管病領域的研究重點。

丹酚酸B是丹參水溶性酚酸類成分的主要活性物質，目前有關其在抗氧化應激損傷心肌細胞的保護作用相關文獻未見報道。本研究利用H2O2制備體外培養心肌細胞氧化損傷模型，研究丹酚酸B對H2O2致氧化應激損傷心肌細胞的保護作用，結果顯示：與正常對照組比較，模型組心肌細胞出現貼壁細胞減少、偽足回縮等細胞損傷性變化，同時細胞存活率也明顯降低；心肌細胞中GSH水平降低，MDA水平升高，SOD活性降低；由于心肌細胞損傷，心肌細胞培養液中釋放的LDH和CK水平增多。脂質過氧化產物MDA水平及SOD活性可直接反映心肌細胞膜脂質過氧化的速度與程度，并間接反映細胞損傷的程度，且與氧自由基的生成情況也有必然聯系。本研究結果顯示：心肌細胞經丹酚酸B處理后，細胞形態學損傷變化減輕，細胞存活率增加；同時細胞中心肌細胞中GSH水平增多，MDA水平降低，SOD活性升高、心肌細胞培養液中LDH和CK水平降低，提示丹酚酸B能夠減輕心肌細胞氧化應激損傷的程度，增強心肌細胞抗氧化防御的能力。

綜上所述，丹酚酸B對氧化應激損傷心肌細胞具有保護作用，其機制可能與其通過增加清除氧自由基、發揮抗脂質過氧化作用、進而提高心肌細胞的抗氧化損傷能力有關。本研究結果對臨床上心肌病的預防與治療具有一定的參考價值，也為丹酚酸B在防治與氧化應激性損傷有關的心臟疾病的應用提供了理論依據。