枸杞多糖水提法提取條件的研究

張 君，段麗爽，常 南

（1.沈陽食品檢驗所，遼寧 沈陽 110136；2.沈陽產品質量監督檢驗院，遼寧 沈陽 110022）

枸杞又有紅寶之稱，是我國一種較為實用的傳統的名貴中藥材。具有養肝補腎、增陰潤肺、益精明目等功效。它含有大量的蛋白質、維生素、多糖、礦物質及其它營養成分?，F代醫藥及生理學認為枸杞中含有豐富的多糖，這些多糖具有很好藥理活性，而且它也是一種免疫增強劑，具有抗衰老、抗氧化、抑制遺傳性損傷、增強造血能力、治療神經衰弱的作用等。目前已經明確其多糖是由阿拉伯糖、半乳糖、木糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖6種糖分聚合而成的酸性雜多糖與多肽或者蛋白質構成的復合多糖為主，同時包括中性雜多糖及葡聚糖等結合而成的復合多糖，是一種天然的大分子物質。近年以來，研究表明，枸杞多糖作為一種新的功能性因子擁有非常廣闊的發展前景。特別是在多糖的藥用保健、純化以及提取等方面，海內外許多專家學者進行了大量的實驗和研究，并提出了一些相關方面的處理工藝。目前國內外常用的關于枸杞多糖的提取方法一般有超聲波提取法、微波浸提法、熱水浸提法、堿液浸提法、超聲-微波萃取法、酶法提取法以及超臨界萃取法等。本實驗采用熱水浸提輔以苯酚硫酸法提取枸杞中的多糖成分，其特點在于：枸杞中的可溶性多糖在濃硫酸的作用下，可水解生成單糖，并且能夠快速的脫水從而生成糠醛或羥甲基類衍生物。該種物質能和苯酚縮合形成一種橙紅色的化合物，可在480納米的波長下產生最大吸光值。實驗中通過對料水比、pH值、提取溫度、提取時間等4組因素的控制，研究其對枸杞中多糖提取量的影響，分析比較各因素的影響能力大小，在得到最適范圍的前提下，優化條件從而得到最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寧夏枸杞（市售）；葡萄糖（分析純，萊陽化工廠）；濃硫酸（分析純，98%）；氫氧化鈉（分析純）；苯酚（分析純，在配置時取蒸餾后的苯酚5克置于100毫升的容量瓶中加水定容）。

1.2 試驗設備與器材

可見分光光度計：VIS-7200A，上海天美科學儀器有限公司；電子天平：AL204-IC，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；酸度計：PB-10，塞多利斯科學儀器（北京）有限公司；鼓風干燥箱：DHG-9145A，上海一恒科技有限公司；萬能粉碎機：FW100，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗方法及設計

熱水浸提法工藝流程為：枸杞→干燥→粉碎→形成粉末→過篩→裝瓶→準確稱量→溶解于錐形瓶中→調節pH值→加塞水浴加熱→提取數小時→過濾→殘渣洗滌→濾液與洗滌液合并。

1.3.1 枸杞多糖的提取步驟 在電子天平上精確的稱取1.0克枸杞粉末若干份，將其分別置于200毫升的錐形瓶中，按照一定的料水比將蒸餾水加入錐形瓶中同時調節到相應的pH值。在水浴箱中加熱到相應的溫度并提取數小時，取出提取液過濾后，殘渣洗滌2～3次。將洗滌液和濾液合并與50毫升的容量瓶中。

1.3.2 單因素試驗的設計 確定提取過程中4個單因素分別為：提取溫度、提取時間、料水比、pH值。

（1）固定料水比為1∶15，pH值為7，提取時間為1.5小時，分別置于35，45，55，65，75，85℃下提取，根據所得的吸光值計算出相應的多糖提取量，確定提取的最佳溫度范圍。

（2）固定料水比為1∶15，溫度為55℃，pH值為7，分別處于0.5，1，1.5，2，2.5，3，4小時下提取相應的時間，測定吸光值進而得多糖提取量，確定提取時間的最佳范圍。

（3）固定溫度為55℃，浸提時間為1.5小時，p H值為7，料水比分別為1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，測定后通過標準方程得到多糖提取量，確定料水比的最佳范圍。

（4）固定提取溫度為55℃，料水比是1∶15，浸提時間1.5小時，分別調節p H值為4，5，6，7，8，9，10，同上述操作一樣確定最佳pH值的范圍。

1.3.3 正交試驗的設計 在單因素確定的最佳范圍下進行L9(34)試驗，測得每組的吸光值大小，根據標準曲線方程得枸杞多糖的提取量，篩選出最佳的提取工藝。

1.4 枸杞中多糖提取量測定

1.4.1 葡萄糖標準曲線的繪制 在天平中準確地稱取20毫克標準葡萄糖溶于500毫升的容量瓶中定容，精確的吸取葡萄糖標準液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2毫升分別置于數個試管中。然后向各個試管中依次加入蒸餾水補至2毫升，并分別加入配置好的5%的苯酚溶液1.0毫升，振蕩搖勻后迅速加入5毫升的濃硫酸，再次搖勻后于冷水中冷卻10分鐘。同時用2毫升的不含有葡萄糖的蒸餾水按上述順序加入其他試劑做空白對照，在480納米處測吸光值。

1.4.2 枸杞中多糖提取量測定過程 從50毫升的容量瓶中精確吸取1毫升的提取液于燒杯中，用蒸餾水將其稀釋30倍后得到待測液。精確吸取待測的樣品的溶液0.4毫升置于試管中，并加蒸餾水補至2毫升，然后再加入5%苯酚溶液1毫升，將試管振蕩搖勻后迅速加入5毫升的濃硫酸，再次搖勻后置于冷水中冷卻10分鐘。同時用2毫升蒸餾水按上述順序加入其他試劑作空白，在480納米處測吸光值大小。

2 結果與分析

2.1 繪制標準曲線

標準曲線的方程為A=0.2889X+0.0206，R2=0.9906。

2.2 單因素試驗

2.2.1 提取溫度對多糖提取量的影響 固定料水比為1∶15，pH值為7，浸提時間為1.5小時，分別在35，45，55，65，75，85℃下提取，按照1.4.2中方法進行測定，結果見圖1。

圖1 溫度和多糖提取量的關系

由圖1可知，在其他因素不變的情況下，枸杞多糖提取液中的糖分含量隨著提取溫度的不斷升高，數值也呈現出上升的趨勢。在55℃之前增加的幅度較為顯著，之后增加的幅度不甚明顯，甚至出現了下降的趨勢。這種現象的產生則是由于溫度的升高，加速了多糖的分解，使得活化的分子的數目增加，大大地促進了反應的進行，從而使得吸光值及多糖提取量增大，多糖的提取率得以提高。但根據相關的文獻報道高溫條件下可能會對多糖的活性和結構產生一定的影響。因此，在多糖提取過程中應該對溫度加以控制，使其不能太高而被破壞成分。即最佳溫度為55～75℃。

2.2.2 提取時間對多糖提取量的影響 固定料水比為1∶15，提取溫度為55℃，pH值為7，分別在0.5，1，1.5，2，2.5，3，4小時下提取，按照1.4.2中的方法進行，結果見圖2所示。

圖2 時間和多糖提取量的關系

由圖2可知，多糖提取量隨著加熱時間的延長，也在不斷的增加。在2小時之前的一段時間內增加較為顯著，之后逐漸趨于平緩甚至下降。這說明在適當的范圍內，提取時間的增加使多糖的提取效果更加充分。并且這個過程給予了多糖足夠的擴散時間，從而使得吸光值增加，多糖的提取量上升，提取率升高。但是隨著時間的繼續延長多糖提取量的變化幅度卻在漸漸減小，而這種情況則間接地指出某一階段之后，時間的延長已經無法進一步的促使多糖更加充分的擴散于溶液中。因此最佳提取時間應選擇在1.5～2.5小時之間，以保證試驗環境處于最適宜的條件下。

2.2.3 料水比對多糖提取量的影響 固定溫度為55℃，提取時間為1.5小時，pH值為7，料水比分別采用1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，按照上述多糖測定的方法進行提取，結果見圖3。

圖3 料水比和多糖提取量的關系

從圖3中可以看出，在提取時間，提取溫度以及pH值一定的情況下，隨著水量的不斷增加，提取液中的多糖提取量也在持續的增大。這是由于溶劑的增多有利于枸杞中可溶性多糖成分的擴散，使多糖有足夠的空間溶出進而進入提取液中，從而使其吸光值和多糖提取量增加，多糖提取率也隨之上升。而且在料水比為1∶25之前，多糖的增加幅度比較明顯，之后則趨于穩定。是因為一定程度的水量增加可以使提取效果明顯升高，超過某一限定值后，除濃度被稀釋外此條件也不再是主要的影響因素。故而在節能高效的原則下應將料水比控制在1∶20～1∶30之間，以使試驗達到最佳的效果。

2.2.4 pH值對多糖提取量的影響 固定溫度為55℃，料水比為1∶15，提取時間為1.5小時，分別在pH值為4，5，6，7，8，9，10下，按上面所述的方法對多糖進行提取，并繪制出圖像，結果見圖4。

圖4 pH值和多糖提取量的關系

通過分析可知，在時間、溫度、料水比固定的情況下，pH值對多糖提取量的影響也是較為明顯的。隨著pH值得不斷增大，枸杞多糖提取液的糖分含量呈現上升之勢。在pH值達到8之前，多糖的含量增加較為明顯，之后漸漸趨于穩定，到達一定的程度后又逐漸減少。而這種現象是由于枸杞多糖中糖苷鍵的存在所造成的。糖苷鍵很容易被稀酸催化水解，而一般情況下多糖糖苷鍵對于稀堿是相對穩定的，因此酸性條件下非常不利于多糖成分的穩定。但是，枸杞多糖又是一種酸性的雜多糖，在高溫條件下強堿對其成分的穩定性也會產生一定的影響。因而在對多糖提取工藝的研究中應將最佳pH值控制在8～10為宜。

2.3 枸杞多糖成分提取的多因素正交試驗

在上述4個單因素實驗的基礎上，通過對其結果的分析，進而確定了每個因素的最佳提取范圍。將試驗中所得到的最佳提取范圍進行正交處理，采用L9(34)正交試驗法，按照提取溫度、提取時間、料水比、pH值4個因素，對每個因素進行3個水平設計。通過所得數據選擇出最優的提取工藝。

通過對表2中的正交試驗結果極差分析可得出，各個因素對于枸杞多糖提取效果的影響力各不相同。其影響力的大小順序表現為：提取時間＞料水比＞提取溫度＞pH值。這說明提取時間對多糖成分提取效果的影響是最大的，是影響多糖提取量最主要的一個因素。其他因素對于提取效果也產生了非常大的影響，但它們的效果低于提取時間所產生的作用。并且表中的數據更加清晰的顯示了枸杞多糖的最佳提取工藝為提取溫度為55℃，提取時間為2小時，料水比為1∶25，pH值為9。此時的吸光值為0.936，多糖提取量為0.475克/克。

2.4 多糖提取的穩定性實驗

任意選取一個樣品試樣如：溫度為55℃，提取時間為1.5小時，料水比為1∶15，pH值為7，分別在15，25，35，45，55分鐘條件下，進行不同時間內測定枸杞多糖提取量的試驗。

通過對吸光度的測定可知，多糖提取液的吸光值在15分鐘時就已經趨于穩定了，對應的多糖提取量也逐漸平穩，并且在之后的一段時間內沒有發生明顯的變化。因此在實際操作中可以選擇在15分鐘后的某一時間段開始測定液體的吸光值和多糖提取量。

表1 正交試驗各因素水平表

表2 正交試驗結果分析表

表3 多糖提取的穩定性試驗

3 結論

盡管目前國內外關于多糖的提取工藝存在諸多形式，但究其原因都是為了確定特定方法下的最佳提取方案，使多糖的提取率達到最大。試驗中運用熱水浸提的方法，對影響枸杞多糖的提取因素進行了系統的研究，在對溫度、提取時間、料水比、pH值4個因素進行單因素實驗的基礎上，確定了最適宜的提取范圍：提取溫度為55～75℃，提取時間為1.5～2.5小時，料水比為1∶20～1∶30，pH值為8～10。

在單因素試驗之后又對上述4個因素進行正交試驗，進而在正交試驗的基礎上得到不同因素的影響能力各有差異，從影響效果上可以看出它們的大小順序為：提取時間＞料水比＞提取溫度＞pH值。并且通過對吸光值和多糖提取量的分析可知最佳的提取工藝為：提取時間2小時，料水比為1∶25，提取溫度55℃，pH值為9。在該條件下其吸光值為0.936，多糖提取量為0.475克/克。

此外，也對枸杞多糖提取的穩定性進行了試驗，確定了15分鐘后的一段時間內提取液的吸光值和多糖提取量無明顯變化，這也為其他類似試驗的研究提供了一個可供參考的依據。