超高壓法提取山杏多酚工藝優化

付婷婷，李尊強，張學義，么宏偉，趙鳳臣，韓書昌，吳洪軍*，謝晨陽

(1.黑龍江省林副特產研究所，牡丹江 157011；2.黑龍江省煙草公司煙草科學研究所，哈爾濱 150000)

山杏[Armeniacasibirica(L.) Lam]，為薔薇科杏屬，原產我國及亞洲西部,是亞洲特有的生態經濟型樹種[1]；除此之外，山杏根系發達、不僅耐寒、耐旱，而且還耐瘠薄、耐高溫,是營造水土保持林的優良植物材料和生態脆弱地區植被恢復的先鋒樹種[2]。

山杏有很多的功能，羅艷和劉梅[3]研究發現山杏可用作生物柴油原料，值得推廣；史清華等人研究發現杏仁蛋白含有人體必需的8種氨基酸，具有較高的營養功能[4]；杏殼活性炭具有碘值高，質地堅硬，孔隙密度大、吸附能力強、比表面積高等優點，并且不含人體有害物質、可以再生和重復使用，是生產高檔活性炭的優質原料[5]；苦杏仁還具有某些藥用價值，有鎮咳平喘[6]、輔助治療癌癥[7]、鎮痛[8]等作用，且苦杏仁含有豐富的微量元素，其中防癌能力很強的硒含量為各類果仁之冠[9]。目前對于山杏資源的加工利用的產品比較少，僅有果核提取杏仁油、蛋白等成分，大部分果肉往往被丟棄，利用價值很低，山杏分布區域落果期可見漫山遍野的果肉廢棄和腐爛，既浪費了大量的寶貴資源，同時又造成了一定的環境污染。因此，變廢為寶，開發利用山杏果品資源，亦為本研究宗旨所在。

多酚是一種天然的還原劑，能有效阻止活性氧、氮的增加，調節機體內氧化劑和還原劑的穩態，有效防止或削弱生物大分子的氧化損傷，從而對氧化損傷導致的心血管病，癌癥和衰老等慢性病起到預防作用[10]。超高壓處理為近年來興起的非熱加工技術，此技術提取產物能耗低、雜質形成少、提取時間短，只破壞非共價鍵而共價鍵的活性成分不受破壞，故不單用于食品中的滅酶、滅菌工作，還可用于協同強化萃取[11-12]，其在食品中的應用越來越受到人們的重視。范金波[13]采用超高壓法提取牛蒡根多酚，提取率高達10.7%，并且此多酚具有較強的抗氧化能力；楊小蘭[14]用超高壓法處理4種獼猴桃，結果顯示超高壓能顯著提高獼猴桃漿多酚含量。

本研究以山杏為原料，通過考察料液比、乙醇濃度、反應壓力對山杏多酚提取率的影響，采用Box-Behnken響應面分析法對其提取工藝條件進行優化，以期為山杏資源開發提供數據支撐。

1 實驗材料

1.1 實驗材料

山杏采自于牡丹江市北山周圍，樹齡超過5年，取8月份果實。洗凈晾干冷凍保存備用。本試驗所用試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

旋轉蒸發儀RE-52A(上海亞榮生化儀器廠)；紫外可見分光光度計：U-3010，日本HITACHI株式會社；超高壓食品處理裝置HPP.L3-600/0.6型，天津華泰森淼生物工程公司。

2 方法

2.1 山杏多酚的提取

山杏洗凈，去核，打漿，定量裝袋，封口，超高壓處理(按各步實驗要求設置處理壓力)10min，冷凍保存。

取10g樣品果肉，浸泡在50mL 80%乙醇中，置于搖床中提取1h，提取完畢過濾，濾液在10000r/min下離心10min，取上清液。提取過程重復3次，合并濾液，旋轉蒸發至體積為10mL。濃縮后的提取物儲存于-20℃的冰箱中備用。

2.2 多酚含量的標準曲線繪制

多酚含量用福林酚法。準確稱量25mg沒食子酸，去離子水溶解并定容至25mL，以該沒食子酸溶液為母液，依次配制成質量濃度分別為0、20、60、100、150、200、300、500μg/mL的梯度液。取標準溶液100μL與去離子水400μL于玻璃試管中，加福林酚試劑100μL，混勻，6min后加入7%Na2CO3溶液1mL和去離子水0.8mL，混勻后避光放置，90min后于760nm波長處測定吸光度。標準曲線方程：y=0.0042x+0.0178(R2=0.9981)。

2.3 樣品多酚含量測定

準確吸取樣液100μL，其余步驟同2.2。按公式計算樣品多酚含量。

式中：W為多酚含量μg/mL，ρ為沒食子酸質量濃度μg/mL，V為提取液體積mL，N為稀釋倍數，100為樣液體積mL。

2.4 單因素試驗

以多酚提取率為衡量指標，分別研究料液比、乙醇濃度、反應壓力3個因素對山杏多酚提取率的影響。

表1 單因素試驗設計

2.5 響應面實驗

根據單因素試驗結果，設計3個因素進行3因素3水平的響應面實驗，以多酚提取率為指標，確定最優提取工藝參數。

2.6 數據處理

每種實驗重復3次取平均值，數據處理用Design-Expert8.0.0軟件分析。

3 結果分析

3.1 超高壓處理對山杏多酚提取率的影響

圖1 超高壓對山杏多酚提取率的影響

由圖1可以看出，樣液經超高壓處理后，多酚的含量顯著提高。常壓提取的山杏多酚提取率為8.5%，經300MPa高壓處理后多酚含量增至12.1%。

3.2 單因素試驗結果

3.2.1 料液比對山杏多酚得率的影響

圖2 料液比對山杏多酚得率的影響

由圖2可知山杏多酚隨著料液比的增加而增大，在料液比40mL/g時多酚得率最大，為9.01%，而后隨著料液比的增大，多酚得率逐漸降低。因此選取最優提取料液比40mL/g。

3.2.2 乙醇濃度對山杏多酚得率的影響

圖3 乙醇濃度對山杏多酚得率的影響

從圖3可知，乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%，多酚得率分別為5.7%、8.81%、10.32%、8.5%和6%。在乙醇濃度70%時多酚得率10.32%顯著高于其他濃度。所以選取70%為最優乙醇濃度。

3.2.3 反應壓力對山杏多酚得率的影響

圖4 反應壓力對山杏多酚得率的影響

由圖4可知壓力在100～300MPa范圍內，多酚得率與反應壓力呈正比。在300MPa時，多酚得率高達13.07%。而壓力在300～500MPa時，多酚得率與反應壓力呈反比。故選取300MPa。

3.3 響應面優化分析

3.3.1 響應面試驗結果

根據單因素實驗結果，篩選出3個山杏多酚得率最高的水平進行響應面分析，因素水平設置見表2。

表2 響應面設計因素水平

根據表3實驗結果建立的響應值與各因子的二次回歸擬合方程為：

Y=12.19-1.13A-1.54B+1.03C-0.48AB+0.21AC+0.49BC-3.86A2-2.95B2-2.02C2

表3 響應面設計與實驗結果

3.3.2 響應面結果分析

為了檢驗方程的有效性，對其進行了回歸模型方差分析，結果如表4所示。模型F值為17.07，P值0.0006<0.01，說明模型極顯著；失擬項P值0.2487>0.05(差異不顯著)，說明擬合的二次回歸模型是適當的；模型的相關系數R2=0.9968表明實測值與預測值有高度的相關性；校正系數AdjR2=0.9898說明改模型能解釋98.98%的響應值變化。由上述可知，該模型可靠，可以用該模型對山杏多酚提取進行分析和預測。此外，從表4還可看出一次項B，二次項A2、B2、C2對響應值影響極顯著(P<0.01)；A、C對響應值影響顯著(P<0.05)。通過比較F值可知，3因素對響應值的影響，大小順序為乙醇濃度>料液比>反應壓力。

表4 回歸模型方差分析

注：“**”表示極顯著水平(P<0.01)，“*”表示顯著水平(P<0.05)。

3.3.3 響應面分析

圖5 各兩因素交互作用對多酚提取率的響應面和等高線

兩因素交互作用的響應面及其等高線見圖5。得率隨料液比、乙醇濃度、反應壓力的增大呈現出先增后降的趨勢，說明3個因素在所選范圍內能產生最佳的響應值，曲面的陡峭程度反映了處理條件對響應值的影響程度。

3.4 山杏多酚提取工藝條件的確定

利用Design-Expert軟件對工藝條件進行優化分析，預測山杏多酚最佳提取條件為料液比39mL/g，乙醇濃度68%，反應壓力322MPa，此時條件下提取山杏多酚的得率為12.55%。采用此工藝進行3次重復試驗，得到山杏多酚的得率平均值為12.5358%，接近預測值，表明模型科學合理，具有實用價值。

4 結論

通過單因素試驗和Box-Behnken響應面分析法對高壓提取山杏多酚工藝進行了優化，得到了最佳提取條件，在此條件下山杏得率理論值與預測值比較接近，證明模型方程是合理有效。為山杏資源綜合利用的開發提供了一定的理論依據。