太子參多糖對缺血再灌注損傷模型大鼠心肌細胞凋亡的抑制作用研究

孫弼 宛蕾 林曉堅 張艷 何迅 廖尚高

摘 要 目的：研究太子參多糖對心肌缺血再灌注損傷模型大鼠心肌細胞凋亡的抑制作用，并探討其作用機制。方法：取SD大鼠72只，隨機分為假手術組、模型組、陽性藥物組（硝苯地平片，5 mg/kg）和太子參多糖低、中、高劑量組（7.5、15、30 g/kg），每組12只。假手術組和模型組大鼠均灌胃水，其余組大鼠分別灌胃相應藥物7 d后，全部大鼠以結扎左冠狀動脈前降支使心肌缺血30 min后再灌注120 min的方法建立缺血再灌注損傷模型（其中僅假手術組大鼠穿線但不結扎）。采用蘇木精-伊紅染色法，在顯微鏡下觀察大鼠心肌組織病理學變化；采用TUNEL法檢測大鼠心肌細胞凋亡情況；采用Western Blot法檢測心肌組織中Bax、Bcl-2和胱天蛋白酶3（Caspase-3）蛋白表達水平。結果：與模型組比較，太子參多糖各劑量組大鼠心肌組織的病理學變化程度明顯減輕，心肌細胞凋亡數量明顯減少；太子參多糖各劑量組大鼠心肌組織中Bax蛋白表達水平以及Bax/Bcl-2蛋白表達水平比值均顯著降低，低、中劑量組Caspase-3蛋白表達水平均顯著降低，高劑量組Bcl-2蛋白表達水平顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。結論：太子參多糖能顯著減輕心肌缺血再灌注損傷模型大鼠的心肌組織損傷，并抑制心肌細胞凋亡，該作用可能是通過下調促凋亡相關蛋白Bax、Caspase-3和上調抑凋亡相關蛋白Bcl-2的表達來實現的。

關鍵詞 太子參；多糖；大鼠；缺血再灌注損傷；心肌細胞；凋亡；Bax；Bcl-2；Caspase-3

中圖分類號 R965；R258 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）16-2175-05

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the inhibitory effects of Pseudostellaria heterophylla polysaccharide on myocardial apoptosis of ischemia-reperfusion injury （IRI） model rats， and to investigate its mechanism. METHODS： Totally 72 SD rats were selected and randomly divided into sham operation group， model group， positive drug group （Nifedipine tablets， 5 mg/kg） and P. heterophylla polysaccharide high-dose， medium-dose and low-dose groups （7.5， 15， 30 g/kg）， with 12 rats in each group. Sham operation group and model group were given water intragastrically， and other groups were given relevant medicine intragastrically for 7 d. The IRI model was established by ligating the anterior descending branch of left coronary artery， reperfusing 120 min after 30 min of myocardial ischemia （not occluded only in sham operation group）. HE staining was used to observe the pathological changes of myocardium in rats under microscope. Myocardial apoptosis was detected by TUNEL method. The protein expression levels of Bax， Bcl-2 and Caspase-3 in myocardial tissue were detected by Western blot method. RESULTS： Compared with model group， pathological changes of myocardial tissue were relieved significantly in P. heterophylla polysaccharide groups， while the number of myocardial cell apoptosis was decreased significantly. The protein expression levels of Bax， the protein expression ratio of Bax and Bcl-2 in myocardial tissue were decreased significantly in P. heterophylla polysaccharide groups； those of Caspase-3 in P. heterophylla polysaccharide low-dose and medium-dose groups were decreased significantly； those of Bcl-2 were increased significantly in P. heterophylla polysaccharide high-dose group， with statistical significance（P<0.05）. CONCLUSIONS： P. heterophylla polysaccharide can significantly relieve myocardial tissue injury and inhibit myocardial apoptosis in IRI model rats. Its mechanism may be associated with reducing proapoptotic protein Bax and Caspase-3 and raising apoptotic protein Bcl-2 expression.

KEYWORDS Pseudostellaria heterophylla； Polysaccharide； Rat； Ischemia-reperfusion injury； Cardiomyocyte； Apoptosis； Bax； Bcl-2； Caspase-3

在多數情況下，缺血后再灌注可使組織器官功能得以恢復，其損傷結構得到修復；但在有些情況下，缺血后再灌注不僅不能使組織器官功能恢復，反而會加重組織器官的功能障礙和結構損傷，這種現象稱為缺血再灌注損傷（IRI）[1]。近年來研究表明，氧化應激、心肌缺血缺氧、再灌注損傷等不僅會引起心肌細胞壞死，還可誘導心肌細胞凋亡[2]，而心肌細胞凋亡將直接影響心肌組織損傷程度[3]。細胞凋亡是受一系列程序控制并通過信號通路介導的病理過程，阻斷其信號通路將有助于阻斷凋亡的發生，防止心肌細胞數量的減少，達到維持或改善心功能的目的[4]。

太子參為石竹科植物孩兒參[Pseudostellaria heterophylla（Miq.） Pax ex Pax et Hoffm.]的干燥塊根，具有抗應激、抗疲勞及改善心肌梗死所致慢性心力衰竭等藥理活性[5]，但其機制是否涉及細胞凋亡過程尚未見報道。有研究表明，太子參多糖對大鼠心肌缺血具有保護作用，可預防心律失常、促進氧自由基清除、減少心肌損傷[6]，但未見關于其抗心肌缺血再灌注損傷作用的報道?；诖?，筆者研究了太子參多糖對缺血再灌注損傷模型大鼠心肌細胞凋亡的影響，旨在探討其對心肌細胞凋亡的抑制作用及其可能的作用機制，為其進一步開發和臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

HX-300S型動物呼吸機、BL-420S生物機能實驗系統（成都泰盟科技有限公司）；5810R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；1645050型電泳儀、ChemiDoc XRS+型化學發光成像系統（美國伯樂生命醫學產品有限公司）；2135型石蠟切片機（德國Leica公司）；SynergyHTX型酶標儀（美國BioTek儀器有限公司）；TS-8型搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；U-LH100HG型光學顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）。

1.2 藥材、藥品與試劑

太子參多糖浸膏[由貴州醫科大學國家苗藥工程技術中心/教育部民族藥與中藥開發應用工程研究中心提供：取貴州省黃平縣太子參種植基地的太子參藥材，經水提取后過D101大孔樹脂，以水洗脫后再經70%～80%乙醇沉淀并除蛋白，制得多糖浸膏（每1 kg生藥含122.9 g多糖）]；硝苯地平片（北京太洋藥業股份有限公司，批號：100908，規格：10 mg）；TUNEL原位檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號：KGA7022-B）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨（SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：20170815、20170830）；β-肌動蛋白（β-actin）抗體（北京博奧森生物技術有限公司，批號：AG07197903）；Bax抗體（美國Proteintech公司，批號：50599-2-1g）；Bcl-2抗體（美國Bioworld公司，批號：CC893300）；胱天蛋白酶3（Caspase-3）抗體（美國Cell Signaling公司，批號：18）；辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（中杉金橋生物技術有限公司，批號：ZB-2301）；RIPA裂解液（上海碧云天生物技術有限公司，批號：P0013B）；磷酸鹽緩沖液（PBS）為本教研室自制（pH 7.4）；其余試劑均為市售分析純，實驗用水為雙蒸水。

1.3 動物

SPF級健康SD大鼠，7周齡，體質量220～260 g，雌雄各半，購自重慶騰鑫生物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（軍）2012-0011。大鼠均適應性喂養1周后進行實驗。

2 方法

2.1 動物分組、給藥及造模

參照文獻[7]，取大鼠72只，按體質量隨機分為6組，分別為假手術組、模型組、陽性藥物組（硝苯地平片，5 mg/kg）和太子參多糖低、中、高劑量組（7.5、15、30 g/kg），每組12只，雌雄各半。每天在上午固定時間，按體質量灌胃0.1 mL/kg（陽性藥物組和太子參多糖各劑量組大鼠按照預設劑量將硝苯地平片或太子參多糖浸膏溶于水后灌胃，假手術組和模型組大鼠則灌胃相應體積的水），qd，連續給藥7 d。

參照文獻[8]建立模型：在第7天給藥30 min后，大鼠經10%水合氯醛（0.04 mL/kg）腹腔注射進行麻醉，固定于手術板上，去除頸部和胸部毛發并消毒；于頸部正中作切口，鈍性分離暴露氣管，沿向心方向剪一切口，插入氣管插管，連接動物呼吸機；將生物機能實驗系統電極分別插入對應四肢皮下，記錄標準Ⅱ導聯心電圖；隨后沿胸部左側切口，撐開胸骨左緣第3～4 肋間肌，暴露心臟后，輕輕撕開心包膜，沿左心耳下緣 1～2 mm處以5/0絲線穿線結扎左冠狀動脈前降支（深度約1～2 mm，寬度約3～4 mm），以結扎線以下心肌顏色變暗且心電圖ST段抬高作為心肌缺血標志；結扎后迅速將心臟送回胸腔，關閉胸腔并縫合。假手術組大鼠僅穿線但不結扎，其余手術步驟相同。結扎30 min后，再次打開大鼠胸腔，小心剪開結扎線以恢復冠脈血流，待心跳穩定5 min后，關閉胸腔，擠出胸內氣體，逐層縫合胸腔，再灌注120 min。全程記錄大鼠心電圖。

缺血再灌注完畢后，打開大鼠胸腔，取出心臟，以生理鹽水洗凈，于10%中性甲醛中固定或于-80 ℃冰箱保存，供后續實驗使用。

2.2 心肌組織病理學觀察

取經10%中性甲醛固定的心肌組織，常規石蠟包埋，切片（厚度4 μm），二甲苯脫蠟，經各級乙醇至水洗后，經蘇木精-伊紅（HE）染色，再常規脫水、透明、樹脂封片，于顯微鏡下觀察心肌組織病理學變化。

2.3 心肌細胞凋亡檢測

采用TUNEL法檢測心肌細胞凋亡情況。按照試劑盒說明書，取經10%中性甲醛固定的心肌組織，以石蠟包埋切片后，在末端脫氧核苷轉移酶（TdT酶）催化下加入熒光素標記的三磷酸脫氧尿苷（dUTP）。在顯微鏡下觀察細胞凋亡情況，正常細胞呈藍色，凋亡細胞呈棕色。

2.4 心肌組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達水平測定

采用Western Blot法測定Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達水平。每組取5只大鼠心尖部分的少量組織，剪成小塊，加入預冷的RIPA裂解液，在冰盒中快速研磨制成組織勻漿，于4 ℃低溫條件下以12 000 r/min離心5 min。取上清液，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書操作進行反應后，采用酶標儀于562 nm波長處測定吸光度，計算蛋白含量，再加入適量SDS上樣緩沖液制成含心肌組織蛋白總量為30 μg的樣品，煮沸變性。取變性預處理后的蛋白樣品以15% SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉膜，室溫下以5%脫脂奶粉置于搖床上封閉1 h；然后加入稀釋后的一抗[β-actin（1 ∶ 5 000）、Bax（1 ∶ 5 000）、Bcl-2（1 ∶ 1 000）、Caspase-3（1 ∶ 1 000）]，4 ℃冰箱孵育過夜；次日以TBST緩沖液漂洗后，加入相應的二抗（1 ∶ 5 000），室溫下置于搖床上孵育1 h后，采用超敏電化學發光（ECL）液進行曝光。以β-actin作為內參，用Image Lab 4.0軟件分析相應蛋白條帶與內參的相對灰度值，以表示蛋白表達水平。

2.5 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s表示，采用單因素方差分析。方差齊時，采用LSD檢驗；方差不齊時，采用Dunnetts t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠心肌組織病理學觀察結果

假手術組大鼠心肌細胞形態分布規則、排列整齊，細胞結構清晰、著色均勻，未見病變跡象。模型組大鼠心肌細胞排列紊亂，部分區域變性壞死，細胞腫脹破裂，部分核固縮、消失，可見部分空泡變性，心肌間質水腫、可見紅細胞。與模型組比較，陽性藥物組和太子參多糖各劑量組大鼠有少量心肌細胞排列紊亂，組織纖維著色相對清晰，區域性變性壞死情況有所減輕，腫脹細胞有所減少，可見少部分核固縮，空泡變性和間質水腫情況均有所減輕，間質中紅細胞明顯減少，其中尤以陽性藥物組和太子參多糖高劑量組效果更明顯。各組大鼠心肌組織病理學顯微圖見圖1。

3.2 各組大鼠心肌細胞凋亡情況檢測結果

假手術組大鼠心肌組織以藍色正常細胞為主，僅可見個別棕色凋亡細胞。模型組大鼠心肌組織中棕色凋亡細胞數量明顯增多。與模型組比較，陽性藥物組和太子參多糖各劑量組大鼠心肌組織中凋亡細胞數量均有所減少。各組大鼠心肌細胞凋亡情況顯微圖見圖2（圖中粗箭頭所指為藍色正常細胞，細箭頭所指為棕色凋亡細胞）。

3.3 各組大鼠心肌組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達水平測定結果

與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織中Bax、Caspase-3蛋白表達水平以及Bax/Bcl-2蛋白表達水平比值均顯著升高，Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。與模型組比較，陽性藥物組和太子參多糖各劑量組大鼠心肌組織中Bax蛋白表達水平以及Bax/Bcl-2蛋白表達水平比值均顯著降低，陽性藥物組和太子參多糖低、中劑量組Caspase-3蛋白表達水平均顯著降低，陽性藥物組和太子參多糖高劑量組Bcl-2蛋白表達水平均顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）；但太子參多糖高劑量組Caspase-3蛋白表達水平以及低、中劑量組Bcl-2蛋白表達水平變化的差異均無統計學意義（P>0.05）。各組大鼠心肌組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白電泳圖見圖3，蛋白表達水平比較見表1。

4 討論

太子參有益氣健脾、生津潤肺之功效，臨床上可單獨使用或與其他中藥配伍使用，或用于成方制劑[9]。沈祥春等[7]研究發現，太子參水煎液能改善大鼠急性心肌梗死后的慢性損傷、心力衰竭后的血流動力學及冠脈結扎所誘導的心力衰竭，能防治梗死后慢性心力衰竭和心肌重構。多糖作為所有生命有機體的重要組成部分，參與多種生命功能活動，其作用主要有增強免疫、抗疲勞、活血抗栓、降血壓、降血脂、降血糖、抗衰老、增強骨髓造血功能、抗輻射等[10]?，F代藥理學研究表明，多糖是太子參的重要活性成分，具有降糖、降脂等作用[11]。

本研究通過對大鼠心肌組織進行HE染色并在顯微鏡下觀察發現，與假手術組比較，模型組大鼠心肌細胞呈現出排列紊亂，組織變性壞死、腫脹，細胞核固縮，間質水腫等組織病理學改變；而與模型組比較，陽性藥物組和太子參多糖各劑量組大鼠上述組織病理學改變明顯減輕，尤以陽性藥物組和太子參多糖高劑量組效果更明顯。由此表明，太子參多糖對大鼠心肌組織具有明顯的保護作用，能夠減輕缺血再灌注后的心肌組織損傷。

近年來研究發現，心肌缺血再灌注損傷與細胞凋亡之間有著密切的關系，后者在心臟的生理、病理發展過程中起著重要作用，被認為是心臟由代償性變化向病理性變化發展的細胞學基礎[12]。已有研究證實，心肌細胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷過程中起關鍵作用[13]。細胞凋亡受細胞內凋亡調節蛋白的調控，這類蛋白分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩大類，這兩類相互拮抗的蛋白之間的平衡喪失將導致細胞凋亡[14]。Bcl-2基因家族是細胞凋亡信號轉導途徑中具有重要作用的基因家族，其中Bcl-2、Bax分別是該家族中最具代表性的一對功能相對獨立的抑凋亡和促凋亡基因[15]。其編碼蛋白Bax/Bcl-2是調控細胞凋亡的“可變電阻器”，在外界因素刺激下，細胞存活/凋亡最終取決于Bax和Bcl-2兩種調控因子的平衡結果，兩者比值的升高/降低標志著細胞凋亡進程的激活/抑制[16]。另有研究表明，胱天蛋白酶家族（Caspase）是哺乳動物細胞凋亡的啟動者和執行者，其中Caspase-3是Caspase級聯“瀑布”下游中最關鍵的凋亡蛋白酶[17]。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠心肌細胞凋亡明顯增多，心肌組織中Bax、Caspase-3蛋白表達水平以及Bax/Bcl-2蛋白表達水平比值均顯著升高，而Bcl-2蛋白表達水平則顯著降低，表明細胞凋亡模型成功建立；而與模型組比較，陽性藥物組和太子參多糖各劑量組大鼠心肌組織中Bax蛋白表達水平以及Bax/Bcl-2蛋白表達水平比值均顯著降低，陽性藥物組和太子參多糖低、中劑量組Caspase-3蛋白表達水平均顯著降低，陽性藥物組和太子參多糖高劑量組Bcl-2蛋白表達水平均顯著升高，表明太子參多糖具有抑制心肌細胞凋亡的作用。但太子參多糖各劑量組間的效果并未呈嚴格的劑量依賴性，其具體原因有待進一步研究探討。

綜上所述，太子參多糖對心肌缺血再灌注損傷模型大鼠的心肌組織具有保護作用，能有效減輕心肌組織損傷，其作用機制可能是通過下調Bax、Caspase-3和上調Bcl-2的蛋白表達，并降低Bax/Bcl-2蛋白表達水平比值，從而抑制細胞凋亡的發生。

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（收稿日期：2018-02-05 修回日期：2018-06-22）

（編輯：段思怡）