基于“腸外翻—心肌細胞”聯用模型的益氣活血方藥效學作用評價及機制探討

耿亞+楊洪軍+馬月香+張晶晶+張毅+李德鳳+張方博+許海玉

[摘要]該研究首先建立過氧化氫（H₂O₂）誘導大鼠胚胎心肌細胞株（H9c2）氧化損傷模型，并篩選出益氣活血方腸吸收液體外心肌保護作用的濃度范圍，優選出4個劑量進行實驗；通過考察益氣活血方腸吸收液對H9c2的保護作用，從而為臨床防治與氧化應激損傷相關心臟疾病提供參考；并通過對H9c2心肌細胞活力、細胞形態、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）等指標進行考察，對益氣活血方腸吸收液作用機制進行初步評價探討。結果顯示，益氣活血方腸吸收液對H₂O₂誘導H9c2心肌細胞損傷具有較好的保護作用，且呈現出一定的濃度依賴性，可提高SOD的活性，減少MDA的釋放，從而降低異常細胞的形成，增強心肌細胞抗氧化能力，提高細胞活力，具有一定的保護作用。

[關鍵詞]益氣活血方； 心肌細胞； 氧化應激； MDA； SOD

[Abstract]This research firstly establishes the oxidative damage model of H9c2 induced by H₂O₂ and screens the concentration range of intestines absorption liquid of Qi benefiting and blood circulation activating formula which possess external myocardium protection function. Then， the thesis chooses 4 dosages to conduct experiments：examining the protection function of intestines absorption liquid of Qi benefiting and blood circulation activating formula on H9c2 to provide reference for clinical prevention and curing of relative heart diseases of oxidative stress injury； as well as examining the H9c2 cardiac muscle cell vigour， cellular morphology， SOD， MDA and other indexes to primarily evaluate and discuss the functional mechanism of intestines absorption liquid of Qi benefiting and blood circulation activating formula. The results show that the intestines absorption liquid of Qi benefiting and blood circulation activating formula has relatively better protection function toward the H9c2 cardiac muscle cell damage induced by H₂O₂ and presents concentration dependency to some extent. The intestines absorption liquid of Qi benefiting and blood circulation activating formula can increase SOD vigour， and decrease MDA emission， thus decreasing the formation of abnormal cell and strengthening the oxidation resistance of cardiac muscle cell. The intestines absorption liquid of Qi benefiting and blood circulation activating formula has protection function to some extent.

[Key words]supplementing Qi and activating blood circulation； myocardial cells； oxidative stress； MDA； SOD

doi：10.4268/cjcmm20162018

冠心?。╟oronary heart disease，CHD）是指冠狀動脈粥樣硬化使管腔狹窄或阻塞，或/和冠狀動脈痙攣導致心肌缺血缺氧而引起的心臟病，又稱缺血性心臟?。↖HD）。中醫無“冠心病”病名，根據其臨床致病特點，在辯證上應屬于中醫學所指的“胸痹心痛”等范疇。如《素問·痹論》有言：“心痹者，脈不通，煩則心下鼓，暴上氣而喘?！痹诠谛牟≈嗅t診療研究中，冠心病多為本虛標實之癥，因氣虛血瘀、心脈痹阻而發病。治療上多以益氣、活血及益氣活血之法。張珍玉教授在60余年的臨床實踐中，總結出益氣活血是治療冠心病的重要法則，所用經驗方益氣活血方（人參、黃芪、丹參、川芎）為基本方，臨床隨證加減，該方以益氣養心為主，兼以活血通脈，組方精煉，對于冠心病患者療效顯著。本課題選取益氣活血方為考察對象，研究其對氣虛血瘀型冠心病細胞層面的防治作用，以期為臨床防治氣虛血瘀型心臟病及后期機制研究提供參考。

研究發現，益氣活血方可有效防治心氣虛型冠心病，通過提高心肌細胞抗氧化活力，從而減少心肌細胞凋亡數量，進而對大鼠心肌缺血產生保護作用^[1]；另有研究表明，心肌缺血性冠心病可產生大量氧自由基^[2]，這也成為誘導心肌細胞凋亡的主要因素^[3]。因此選用外源性活性氧H₂O₂可使心肌細胞產生大量氧自由基，發生氧化應激反應，進而誘導細胞發生凋亡，心肌細胞凋亡模型的建立多選用這種方法^[4-5]。本研究選用體外H₂O₂誘導產生氧化應激反應建立心肌細胞凋亡模型，對益氣活血方的作用進行考察，同時選用曲美他嗪作為陽性對照藥^[6]。通過四甲基偶氮唑鹽（MTT）測定細胞存活率，并篩選模型建立的H₂O₂濃度及藥物作用濃度，測定細胞內SOD，MDA含量評價心肌細胞氧化損傷程度，同時觀察心肌細胞形態學變化，進而從體外細胞效應角度對益氣活血方進行評價。

1 材料

SPF級SD大鼠，雄性，體重（230±10） g，由北京大學醫學部實驗動物科學部提供，合格證號SCXK（京）2010-0034。大鼠胚胎心肌細胞株H9c2購自中國醫學科學院北京協和醫學院基礎醫學研究所細胞庫。

氯化鈉（NaCl），氯化鉀（KCl），碳酸氫鈉（NaHCO₃），磷酸二氫鈉（NaH₂PO₄），氯化鎂（MgCl₂），氯化鈣（CaCl₂），葡萄糖（C₆H₁₂O₆），二甲基亞砜（DMSO）以上試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；DMEM高糖（美國gibco公司）；雙抗Penicillin-Streptomycin（美國Thermo 公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）購自北京索萊寶科技有限公司；胰酶（美國gibco公司）；曲美他嗪（trimetazidine， TMZ）購自美國Sigma；H₂O₂溶液（美國ACROS，10 mol·L^-1）；MTT購自美國Sigma；T-SOD，MDA試劑盒購自南京建成。

益氣活血方（由人參、黃芪、丹參、川芎組成）由貴州信邦制藥有限公司提供。

倒置顯微鏡（日本OLYMPUS）；超級潔凈工作臺（北京東聯哈爾）；CO₂細胞培養箱（日本三洋）；電子分析天平（德國Sartorius）；多功能酶標儀（美國SpectraMax M5）；臺式離心機（上海盧湘儀器）；旋轉蒸發儀（天津科諾儀器）；電子調溫電熱套（天津市泰斯特儀器）；組織-器官水浴系統（上海奧爾科特儀器）；循環水真空泵（鞏義予華儀器）；細胞超聲粉碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）。

Tyrode 緩沖鹽溶液配制：NaCl 8.0 g、NaHCO₃1.0 g、KCl 0.28 g、NaH₂PO₄0.05 g、MgCl₂0.1 g溶于500 mL蒸餾水中，4 ℃保存備用； CaCl₂0.2 g溶于500 mL蒸餾水中，4 ℃保存備用；用時二者混合均勻，加入葡萄糖1.0 g即得^[7]。

2 方法

2.1 益氣活血方供試液的制備

按人參-黃芪-丹參-川芎3∶2∶2∶1稱取益氣活血方各飲片，精密稱定50 g。以1∶20加入95%乙醇回流提取2 h，自然冷卻，抽濾，得濾液。濾液56 ℃旋轉蒸發至干，以每4 g 原生藥材用25 mL Tyrode緩沖鹽溶液，超聲混勻后得益氣活血方供試液，-20 ℃冰箱保存，使用前置于室溫自然解凍。

2.2 益氣活血方腸吸收液制備

依據本課題組前期研究制備腸吸收液^[8]。充分混勻后于無菌間的超凈臺上用0.22 μm無菌濾膜濾過除菌，將腸吸收液樣品分裝于無菌的EP管中，-20 ℃保存待用。

2.3 心肌細胞培養

細胞進行常規培養，DMEM高糖培養基，10%含胎牛血清，0.2%青霉素、鏈霉素雙抗，0.25%胰酶消化傳代，置于37 ℃，5% CO₂細胞培養箱中培養。選取對數生長期的細胞進行實驗。

2.4 H₂O₂損傷心肌細胞的氧化應激模型制備

消化重懸細胞，并調整細胞濃度至8×10³個/L種入96孔板，設為空白對照組（無細胞培養孔），其余每孔培養基200 μL，置于培養箱培養24 h后，棄去原培養液，每孔加PBS 200 μL洗一遍，第1組加入正常培養基，其余各組加入以無血清培養基稀釋不同濃度的H₂O₂（50，100，200，400，500，600，700，800 μmol·L^-1）溶液進行造模，放入培養箱培養1 h后，各孔加入10% MTT溶液，繼續孵育4 h后，棄去各孔原溶液加DMSO 150 μL，放于搖床上搖動10 min，使用多功能酶標儀測定波長570 nm下吸光度（A），每組6個復孔，取其平均值計算細胞存活率。細胞存活率=（A_正常組-A_干預組）/（A_正常組-A_空白組）×100%。

根據濃度實驗結果選取600 μmol·L^-1H₂O₂溶液進行在不同時間點（15，30，45，60，75，90，105，120 min）的實驗，每組6個復孔，取其平均值計算細胞存活率。

2.5 篩選益氣活血方腸吸收液作用H9c2細胞濃度

消化重懸細胞，并調整細胞濃度至8×10³個/L種入96孔板，設空白對照組（無細胞培養孔），其余每孔培養基200 μL，置于培養箱培養24 h后，棄去原培養液，第1組加入正常培養基200 μL，藥物各組加入以無血清培養基稀釋不同濃度的益氣活血方腸吸收液（0， 7.8， 15.6， 31.3， 62.5， 125， 250， 500 mg·L^-1），陽性對照組加入TMZ（10 μmol），均為200 μL，置于培養箱培養24 h后，棄去原培養液，加入H₂O₂（600 μmol·L^-1 ）溶液對藥物組及陽性對照組進行造模，置于培養箱作用1 h后，更換培養液，各孔再加入10% MTT溶液，繼續孵育4 h后，棄去各孔原溶液加DMSO 150 μL，放于搖床搖動10 min，使用多功能酶標儀測定波長570 nm下A，每組6個復孔，取其平均值計算細胞存活率。

根據益氣活血方腸吸收液濃度篩選結果，選取最佳作用濃度（15.6，31.3，62.5，125 μmol·L^-1）培養H9c2細胞24 h，不進行H₂O₂溶液干預，觀察該濃度下益氣活血方腸吸收液是否對正常培養細胞存在損傷。

2.6 實驗分組

根據實驗設計方案，分為以下幾組，①正常對照組：正常培養的心肌細胞；②模型組（氧化應激組）：心肌細胞培養液中添加600 μmol·L^-1 H₂O₂作用1 h；③益氣活血方藥物組：分別以篩選的益氣活血方腸吸收液適宜濃度干預培養心肌細胞24 h后加入600 μmol·L^-1 H₂O₂繼續作用1 h；④陽性對照組：以曲美他嗪（TMZ）干預培養心肌細胞24 h后再加入600 μmol·L^-1 H₂O₂作用1 h。

2.7 測定不同給藥組中MDA，T-SOD活性

在H9c2細胞給藥培養24 h，H₂O₂溶液作用1 h后，取細胞，消化，離心，置于細胞超聲粉碎儀粉碎細胞，吸取細胞粉碎勻漿進行實驗，嚴格按照說明書檢測MDA，SOD。每組均設3個復孔。

2.8 統計學方法

所有數據均采用SPSS 17.0統計軟件處理，采用單因素方差分析（ANOVA）進行組間比較統計學檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 H₂O₂作用濃度及作用時間

在不同濃度H₂O₂（50，100，200，400，500，600，700，800 μmol·L^-1）溶液作用H9c2細胞1 h后，隨著H₂O₂濃度的增加，細胞活力逐漸減弱，且在高濃度H₂O₂（700，800 μmol·L^-1）作用于細胞時，心肌細胞存活率與H₂O₂濃度不成線性關系^[9]。在600 μmol·L^-1 H₂O₂溶液作用不同時間（15，30，45，60，75，90，105，120 min）后，發現H9c2細胞在此濃度下存在著時間依賴性，隨著作用時間增加，細胞存活逐漸降低。根據濃度、時間實驗結果，在600 μmol·L^-1H₂O₂溶液作用1 h的條件下，濃度摸索實驗中細胞存活率為54.28%±4.10%（圖1A），時間摸索實驗中細胞存活率為56.26%±3.68%（圖1B），故選取此條件進行以下實驗。

3.2 益氣活血方腸吸收液濃度篩選

隨著益氣活血方腸吸收液質量濃度（0， 7.8， 15.6， 31.3， 62.5，125 mg·L^-1）的增加，細胞活力增強，在“量-效”關系上存在一定的劑量依賴性；在低質量濃度（7.8 mg·L^-1）時，對細胞存活力作用不明顯，說明低濃度的益氣活血方腸吸收液對細胞活力沒有明顯作用；在高質量濃度（250， 500 mg·L^-1）時，細胞活力減弱，說明在高濃度的益氣活血方腸吸收液存在一定的細胞毒性（圖2a）。而在15.63， 31.25， 62.50， 125 mg·L^-1孵育正常H9c2時發現無細胞毒性，且具有一定增強細胞活力的作用（圖2b）。故選擇質量濃度為15.63， 31.25， 62.50， 125 mg·L^-1的益氣活血方腸吸收液進行后期實驗研究。

3.3 益氣活血方腸吸收液對H₂O₂誘導的H9c2細胞的氧化損傷作用

與正常組比較，模型組細胞存活率為49.0%；與模型組比較，藥物組細胞存活率明顯提高，說明益氣活血方對H9c2細胞在H₂O₂誘導氧化應激中具有一定的保護作用；在益氣活血方作用于無H₂O₂誘導H9c2細胞時，藥物處理組細胞存活率高于正常組，顯示益氣活血方對H9c2細胞也具有一定增殖作用。在益氣活血方質量濃度為125 mg·L^-1時，細胞抗氧化應激能力最明顯，存活率最高（圖2）。

3.4 H9c2細胞形態學變化

3.4.1 H₂O₂誘導的H9c2細胞形態學損傷 將H₂O₂（50，100，200，400，500，600，700，800 μmol·L^-1）溶液加入到心肌細胞中作用1 h后，置于倒置相差顯微鏡下觀察其形態變化。正常H9c2細胞呈長梭形，H₂O₂誘導后則表現出一種獨特的形態變化，與正常心肌細胞相比較，可觀察到在H₂O₂的氧化損傷下，心肌細胞收縮，形狀不規則，細胞間差距變大，懸浮細胞增加等現象；在H₂O₂ 600 μmol·L^-1組，心肌細胞皺縮明顯，在700，800 μmol·L^-1組，a.加入不同濃度益氣活血方腸吸收液（0， 7.8， 15.6， 31.3， 62.5， 125， 250，500 mg·L^-1）培養H9c2細胞24 h，再加入600 μmol·L^-1 H₂O₂作用1 h；b.加入不同濃度益氣活血方腸吸收液（15.63， 31.25， 62.50，125 mg·L^-1）培養H9c2細胞24 h。與正常對照組組相比**P<0.01，*P<0.05；與模型組相比##P<0.01，#P<0.05。

心肌細胞現大量皺縮現象，懸浮細胞增加。

3.4.2 益氣活血方對H9c2細胞形態學影響 H9c2細胞經過益氣活血方（15.63， 31.25， 62.50， 125 mg·L^-1）和H₂O₂（600 μmol·L^-1）處理1 h后，與H₂O₂模型組相對比，可觀察到隨著益氣活血方濃度的增加細胞收縮減輕，形狀不規則、懸浮細胞等異常細胞的比例逐漸減少（圖3）。

3.5 益氣活血方對氧化損傷心肌細胞SOD，MDA活性影響

H₂O₂誘導的氧化應激反應可使心肌細胞產生一系列病理變化，可通過檢測細胞內MDA，T-SOD的變化來確定益氣活血方是否影響與氧化應激反應相關的氧化酶與抗氧化酶的活性。與正常組比較，模型組細胞中MDA水平顯著升高（P<0.01）；與模型組相比較，各給藥組（31.25，62.50，125 mg·L^-1）細胞中MDA水平顯著降低（P<0.05）（圖4）。與正常組比較，模型組細胞中T-SOD活性顯著降低（P<0.01）；與模型組相比較，各給藥組（15.63，31.25，62.50，125 mg·L^-1）細胞中T-SOD活性水平顯著升高（P<0.05或P<0.01）（圖4）。以上結果表明，藥物組隨藥物濃度增加，T-SOD酶活力增強，而MDA水平降低，通過上調T-SOD，下調MDA 途徑來抑制H₂O₂誘導的氧化應激對心肌細胞的損傷；在藥物質量濃度為125 mg·L^-1時，細胞內MDA，T-SOD水平與TMZ組較接近，這也說明益氣活血方在心肌細胞抗氧化能力方面與TMZ相似。

4 討論

氧化應激是指由于機體氧自由基過量或清除自由基能力減弱，導致氧自由基的增多，進而對機體造成多種毒性作用的病理狀態^[10]。因H₂O₂是一種重要且又易于獲得的活性氧，具有相對穩定的性質?，F代研究表明，高濃度（>1 mmol·L^-1）H₂O₂易使細胞膜脂質過氧化，造成細胞壞死，而低濃度H₂O₂可通過誘導凋亡基因表達，誘發細胞凋亡^[11]，故在實驗中需對H₂O₂濃度進行摸索，確定H₂O₂誘導細胞凋亡的最佳作用濃度。研究發現，氧化應激損傷在心肌缺血再灌注損傷及心力衰竭等疾病中有著重要作用^[12-14]。在心血管疾病從分子細胞水平進行有效藥物篩選及發病機制研究中，H9c2心肌細胞體外培養研究模型已成為主要方法之一^[15]。

益氣活血方為臨床經驗方，主要治療氣虛血瘀型心臟病，臨床療效確切，方中藥物藥理作用在現代有較多研究，人參Panax ginseng C. A. Mey. 在中醫診療中廣泛應用，其主要活性物質是人參皂苷，主要包括Rb₁，Rb₂，Rc，Rg₁等，研究發現人參皂苷Rb₁可有效抑制H₂O₂引起的細胞內鈣離子的升高^[16]，降低LDH漏出量，改善細胞活力，抑制線粒體膜電位降低，降低細胞凋亡水平^[17]；人參皂苷Re在急性心肌缺血再灌注誘導的心肌細胞凋亡中具有一定保護作用^[18]；人參皂苷Rg₁在缺氧-復氧損傷心肌細胞中可有效提高細胞活力^[19-20]；人參皂苷Rg₂在體外低氧損傷心肌細胞中具有抑制細胞凋亡，提高抗氧化酶活力及清除自由基的作用^[21]。黃芪中含有多種活性物質，黃芪甲苷是其主要藥理活性物質之一，研究發現黃芪甲苷對缺氧-復氧誘導H9c2心肌細胞損傷具有一定保護作用，可有效降低MDA含量，提高SOD含量，進而發揮抗氧化作用^[22]；黃芪皂苷Ⅳ通過PI3K/Akt信號通路抗H₂O₂誘導H9c2細胞氧化損傷，顯著提高細胞存活率，減輕細胞凋亡^[23]。丹參中丹參酮Ⅱ_A可有效抑制H₂O₂誘導心肌細胞損傷，顯著降低心肌細胞乳酸脫氫酶（LDH）活性及MDA含量，并可增加總抗氧化能力（T-AOC）、SOD活力，進而對心肌細胞起到保護作用^[24-25]。川芎中川芎內酯A在體外缺氧-復氧誘導乳鼠心肌細胞中，可減少LDH漏出率，降低MDA含量，提高SOD活性，對心肌細胞產生保護作用^[26]。

本研究通過培養H9c2心肌細胞，以外源性H₂O₂誘導建立細胞凋亡模型，首先對H₂O₂誘導的細胞凋亡模型作用條件及益氣活血方作用濃度進行摸索研究，確定作用條件為H₂O₂濃度600 μmol·L^-1，作用時間1 h，確定益氣活血方作用質量濃度為15.6，31.3，62.5，125 mg·L^-1。因活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲臢，而死細胞無此功能^[27]，而MDA具有細胞毒性作用，可與蛋白質分子內和分子間交聯， 誘發細胞凋亡，在金屬離子存在下SOD活性下降可引發脂質過氧化物催化裂解產生MDA^[28]。故本實驗通過檢測心肌細胞存活率、細胞形態學變化、細胞內MDA水平及T-SOD活性來評價心肌細胞氧化損傷狀態，并以此評定益氣活血方對細胞的保護作用。

結果顯示，與正常組比較，模型組心肌細胞存活率明顯降低（P<0.01），細胞形態明顯改變，MDA水平顯著增加（P<0.01），而T-SOD活力顯著減弱（P<0.01），而在加入各濃度益氣活血方預處理后，與模型組相比細胞存活率、T-SOD活力呈濃度依賴性顯著升高（P<0.05或P<0.01），細胞形態學方面得到改善，細胞內MDA水平呈濃度依賴性變化減弱（P<0.05或P<0.01），說明益氣活血方對氧化應激介導的心肌細胞凋亡具有顯著的保護作用，且有一定的增加心肌細胞抗氧化的能力。在作用機制方面，益氣活血方可能通過提高細胞SOD活性，進而增強機體自身清除氧自由基的能力，減少MDA的產生，減輕細胞膜脂質過氧化反應，提高H9c2心肌細胞存活率，從而發揮對缺血損傷心肌細胞的保護作用。在相關機制方面，諸多研究表明，ERK1/2及PI3K信號通路在H₂O₂誘導的細胞氧化損傷過程中發揮重要作用^[29-30]，而益氣活血方是否與此通路相關還有待驗證；益氣活血方是否通過其他機制對心肌細胞產生保護作用，及其具體作用機制方面還需進一步實驗探究。

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[責任編輯 馬超一]