蜜環菌的優化培養研究

梁 艷 ，蘇朝棉 ，周西貝 ，王鵬輝 ，郭 尚 ，王 華 ，張作剛

（1.山西農業大學農學院，山西太谷030801；2.南和縣農業局，河北南和054400；3.山西省農業科學院食用菌研究所，山西太原030031）

蜜環菌（Armillaria mellea）又名榛蘑、蜜環蕈、苞谷蕈、青岡蕈等，是隸屬于擔子菌亞門的一種藥食兼用真菌，能兼性寄生于多種木本、草本植物等樹干基部、根部或倒木上[1-2]，廣泛分布于亞洲、歐洲、北美洲等地的溫帶地區，主要分布于我國20多個省區[3-5]。在傳統中藥材天麻、豬苓等的生長過程中，蜜環菌與它們之間存在極為特殊的營養關聯，是其必不可少的共生菌[6]。菌索入侵天麻的塊莖或豬苓的菌核后被其消化吸收，為它們提供營養[7-10]。蜜環菌菌索多生長于樹根組織中或土壤中，其功能高度分化，不僅可以運送養分，還能生長分化，形成子實體，對不良環境有較強的抵抗力[11-14]。目前，國內外對于蜜環菌的研究和探索，主要集中于生物學特性、化學成分、人工培養、與天麻的共生關系、藥理作用以及相關藥品的開發等方面[15-17]。其中，關于蜜環菌的人工培養是人們所關注的重要方面，進一步研究和探索蜜環菌的培養，對于蜜環菌的研究和開發具有重要意義。

本試驗研究了不同培養基質對蜜環菌萌發時間、生長速度、菌索品質和生長量的影響，以期篩選出最佳的蜜環菌生長條件，為蜜環菌的人工培養及工業化生產提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 蜜環菌由河南盧氏提供。

1.1.2 培養基組分及試劑 胡蘿卜、松針、豆油、麩皮、蘋果枝、木屑、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、蛋白胨、牛肉膏、尿素、瓊脂、乙醇、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、維生素B1。

1.2 方法

1.2.1 不同碳源、氮源、培養基形態及活化時間對蜜環菌萌發和生長的影響

1.2.1.1 不同碳源培養基的制備 基礎培養基：馬鈴薯200 g，磷酸氫二鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，瓊脂粉20 g，維生素 B110 mg，水 1 000 mL，pH 自然。分別在基礎培養基中加入葡萄糖20 g，蔗糖20 g，麥芽糖20 g，淀粉20 g，制成不同的碳源培養基，保持培養基中碳含量等量，按照編號分裝到試管中，滅菌，接入蜜環菌觀察并記錄菌種的萌發和生長情況。每個配方重復3次。

1.2.1.2 不同氮源培養基的制備 制備基礎培養基，分別在基礎培養基中加入蛋白胨、牛肉膏、尿素各5g，制成不同的氮源培養基，保持培養基中氮含量相等，按編號分裝到試管中，滅菌，接入蜜環菌觀察并記錄菌種的萌發和生長情況。每個配方重復3次。

1.2.1.3 不同瓊脂含量的培養基制備 制備基礎培養基，保持培養基中碳、氮含量及成分相同，瓊脂的添加量按 0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%這 5個濃度梯度，按編號分裝到180 mL的試管中，滅菌后，接入蜜環菌觀察并記錄菌種的萌發和生長情況（表1）。每個配方重復3次。

1.2.1.4 不同活化時間 將在冰箱冷藏的蜜環菌菌種放到25℃的恒溫培養箱中活化，設置活化時間為 12，24，36，48，60 h，并進行編號。將活化好的菌種接種到不同培養基，3次重復，并放到25℃的恒溫培養箱中進行培養，每隔12 h觀察并記錄菌種的萌發和生長情況一次，共記錄5次。

1.2.2 不同母種培養基對蜜環菌生長的影響 按表2制作7種培養基，高壓滅菌后，接種蜜環菌，25℃避光培養，14 d后沖洗掉蜜環菌索上附著的瓊脂，70℃下烘干至恒質量，稱取質量即為每瓶收獲的生物量。觀察記載蜜環菌菌索萌發所需時間、菌索密度、菌索頂端整齊度及生長滿瓶所需的天數。同上，制作7種培養基，將等量的培養基分裝在試管內，滅菌后接種蜜環菌，25℃避光培養，每3 d測量蜜環菌菌索的生長長度。每個配方重復3次。

表2 不同母種培養基的配方

1.2.3 不同栽培種培養基對蜜環菌生長的影響選擇直徑1 cm左右的蘋果樹枝，截成長6 cm的枝段，并將兩端削成斜面。將蘋果枝、玉米芯在0.25%硝酸銨溶液中浸泡2 h，將胡蘿卜搗成泥。如表3制作4種培養基各250 mL，加入營養液至剛好淹沒固體。高壓滅菌，接種于三角瓶中，25℃避光培養14 d。菌索長滿瓶后，用溫水沖洗蜜環菌索，挑去雜質木屑，70℃下烘干至恒質量，稱取質量即為每瓶收獲的生物量。每個配方重復3次。

表3 不同栽培種培養基的配方 %

1.2.4 不同添加物對蜜環菌生長的影響 在1000mL蒸餾水中加入100 g胡蘿卜小塊，煮20 min，過濾后制成胡蘿卜提取液。按體積計算分別添加0，1%，2%，5%，10%的胡蘿卜提取液作為處理 1，2，3，4，5，滅菌后，進行接種培養。分別將胡蘿卜、乙醇、豆油添加物按表4加入培養基，滅菌，接種蜜環菌菌塊后置于搖床，在110 r/min，25℃避光條件下培養14 d。培養出的發酵產物過濾后放入烘干箱中干燥至恒質量，用天平稱量。

將松針洗凈，60℃烘干并研磨，然后與水以1∶10的比例放入水浴鍋，90℃浸提1 h，提取2次，合并提取液，過濾，即制成松針浸提液。分別向PDA培養基添加0，5%，10%，20%，30%的松針浸提液制成培養基，高壓滅菌后，將蜜環菌菌塊接種于三角瓶中，25℃避光培養7 d后，沖洗掉蜜環菌索上附著的瓊脂，70℃下烘干至恒質量，稱取質量即為每瓶收獲的生物量，觀察不同濃度松針浸提液培養基對蜜環菌生長的影響。每種處理3次重復。

表4 液體發酵培養基不同添加物的量 %

2 結果與分析

2.1 不同碳源、氮源、培養基形態及不同活化時間對蜜環菌萌發和生長的影響

2.1.1 對蜜環菌萌發時間的影響 不同碳源、氮源、培養基形態及不同活化時間對蜜環菌萌發時間的影響如表5所示。

表5 不同碳源、氮源、培養基形態及活化時間對蜜環菌萌發時間的影響 d

由表5可知，接種在不含瓊脂的1號培養基上的蜜環菌，當活化時間為48 h時，蜜環菌的萌發時間較其他處理顯著縮短，為3.8 d。在其他不同瓊脂濃度的培養基上，48 h處理的平均萌發時間都最短。在2號（0.5%瓊脂）中36 h處理與24，48，60 h處理存在顯著性差異，但48 h處理與其他處理相比萌發時間顯著縮短；在3號（1.0%瓊脂）培養基中，24 h處理與48 h處理存在顯著差異，但48 h處理與其他處理相比萌發時間顯著縮短；在4號（1.5%瓊脂）培養基中，48，60 h處理無顯著差異，但48 h處理與其他處理相比萌發時間顯著縮短；在5號（2.0%瓊脂）培養基中，處理48 h較其他處理萌發時間顯著縮短，僅為4.8 d；在6號（蔗糖）培養基中，處理48 h時的蜜環菌萌發時間最短，僅為4.2 d；在7號（麥芽糖）、8號（淀粉）培養基中，36 h處理與48，60 h處理間存在顯著差異，48 h處理的蜜環菌較其他處理萌發時間縮短；在9號（蛋白胨）中，12 h處理與36，60 h處理存在差異，60 h處理蜜環菌較其他處理萌發時間縮短；在10號（牛肉膏）培養基中，60 h處理的蜜環菌與其他處理相比萌發時間顯著縮短，僅為4.1d；在11（尿素）培養基中各時間梯度不存在顯著差異。

2.1.2 對蜜環菌生長狀況的影響 把蜜環菌菌種活化48 h后接種到不同培養基上，通過分析得出，隨著瓊脂的濃度增加，菌索的分支在減少，菌索顏色由白逐漸變黃，菌索形態由纖細逐漸變粗，菌索密度增加；以淀粉為碳源的培養基前期萌發時菌索分支與葡萄糖、麥芽糖、蔗糖相比較多，菌索顏色在加深，菌索形態細弱，菌索密度也很??；以牛肉膏、蛋白胨為氮源的培養基菌索分支很多，三者的菌索顏色都較深，牛肉膏的菌索形態較粗，菌索密度也較大；而尿素為氮源的培養基菌索分支很少，形態纖細，密度較?。ū?）。

表6 蜜環菌在不同碳源、氮源及形態培養基上的生長情況

2.2 不同母種培養基對蜜環菌生長的影響

2.2.1 對蜜環菌菌索生長速度的影響 由表7可知，蜜環菌菌索前12 d生長速度快慢依次為：松針、胡蘿卜＋PDA、麥麩、牛肉膏、PDA加富、胡蘿卜培養基，蜜環菌菌絲生長速度最快的是松針培養基，前12 d平均高達9.88 cm，生長速度最慢的是木屑培養基，前12 d平均長度僅為3.33 cm，松針培養基生長長度是木屑培養基的3倍左右。

表7 不同母種培養基的蜜環菌菌索生長長度 cm

2.2.2 對蜜環菌菌索生物特性的影響 從表8可以看出，蜜環菌菌索萌發所需時間最短的是松針培養基，為3 d；最長的是PDA培養基和胡蘿卜培養基，為7 d。蜜環菌生物量最高的是松針培養基，然后依次是牛肉膏培養基、胡蘿卜＋PDA復合培養基、木屑培養基、麥麩培養基、PDA加富培養基和胡蘿卜培養基。其中，松針培養基的生物量是PDA加富培養基和胡蘿卜培養基的9倍。

松針培養基滿瓶所需時間最短，為15 d，其次依次是胡蘿卜＋PDA、牛肉膏、木屑、麥麩、PDA加富（胡蘿卜）培養基。松針培養基和牛肉膏培養基上的菌索濃密大、生長勢強、菌索頂端整齊程度高，木屑培養基的生長勢弱于松針培養基和牛肉膏培養基，麥麩培養基和PDA加富培養基上的菌索稀少、生長速度慢、菌索頂端整齊程度較差。

表8 不同母種培養基上蜜環菌菌索的生物特性

2.3 不同栽培種培養基對蜜環菌生長的影響

從表9可以看出，4號培養基上的蜜環菌平均生物量為17.07 g/L，明顯高于其他培養基，分別是1，2，3 號培養基生物量的 2.91，2.90，1.93 倍，說明4號培養基最適合培養蜜環菌的生長。

表9 不同栽培種培養基對蜜環菌生長的影響

2.4 不同添加物對蜜環菌生長的影響

從表10可以看出，從4種添加物對蜜環菌促長的最大生物量來看，松針浸提液促進蜜環菌生長效果最強，添加量為30%（處理5）時，蜜環菌生物量最高，達30.97 g/L；豆油和乙醇次之，添加量分別在0.2%（處理3）和0.8%（處理4）時，二者蜜環菌生物量最高，分別為13.38，18.23 g/L；胡蘿卜添加物的蜜環菌生物量最小，濃度為5%（處理4）時，蜜環菌生物量最高，為7.76 g/L。

表10 培養基添加物對蜜環菌平均生物量的影響 g/L

3 結論與討論

國內外對蜜環菌的探索主要集中在菌絲、菌索等發酵液的藥理成分研究及功效的研究上[18-22]，對人工栽培等方面的相關研究報道較少。本試驗結果闡述不同培養物質對蜜環菌菌株萌發及生長性狀的影響，從蜜環菌的4種不同培養條件中篩選出在培養基中添加一定量的松針液，更有利于促進蜜環菌的生長。

從不同瓊脂添加量對蜜環菌生長的影響情況來看，蜜環菌更適合在菌索生長阻力小的液態培養基中生長。在不同氮源條件培養中，相比尿素培養基，蜜環菌更適合在以牛肉膏和蛋白胨為氮源的培養基環境中生長，說明菌株在生長初期更適合利用牛肉膏和蛋白胨等多種氨基酸蛋白質為營養物質，尿素類單一有機化合物不能充分提供蜜環菌生長所需營養。通過添加松針或松針浸提液，發現能大幅度提高蜜環菌的生長速度和生物量，說明松針當中含有某種物質能夠促進蜜環菌生長，因此，還需要對松針提取物中有效成分進行分析。同時，本試驗還存在一些需要完善的條件設置，比如不同的溫度、光照、pH值以及環境的含氧量高低對蜜環菌生長的影響還需進一步試驗探究。