沙門氏菌及副溶血性弧菌的 共增菌培養基的研制

晨 凡,秦鮮菊,徐思源,寧喜斌,2,3,4,*

(1.上海海洋大學食品學院,上海 201306; 2.上海海洋大學,食品科學與工程國家級實驗教學示范中心,上海 201306; 3.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海 201306; 4.國家淡水水產品加工技術研發中心(上海),上海 201306)

食源性致病菌是引起食源性疾病的主要因素之一,在世界食品安全領域中備受關注。世界衛生組織(WHO)最新研究報告表明,在2015年全球有5600多萬人死亡,其中約有139萬人死于腹瀉病[1]。在眾多食源性致病菌中,沙門氏菌與副溶血性弧菌最受關注。2008～2015年間,我國共有1597起食物中毒事件,其中由食源性致病菌引起的食物中毒占總中毒人數的62.02%,而在所有致病菌中,沙門氏菌和副溶血性弧菌分別在常見微生物食物中毒占比23%和21%,分別為第一和第二位[2-3]。

近年來,在食源性致病菌快速檢測方面,檢測方法主要涉及免疫學、代謝學、以DNA探針等技術為代表的分子生物學等,較之傳統國標法檢測,具有較高的特異性和靈敏性?，F代技術如多重PCR、基因芯片等,甚至可以實現同一平臺上對多種致病菌的檢測[4-7]。同時,檢測方法的快速發展也要求樣品前處理步驟更加快捷,在食源性致病菌的檢測過程中,仍需要對目標菌進行富集培養，但是不同的致病菌有特定的前增菌步驟,沙門氏菌等菌株更是需要進行多步增菌過程,較為費時、費力[8]。因此,研制可同時富集多種致病菌的共增菌培養基成為研究的熱點,這對于提高致病菌共檢技術的效率具有重要意義。沙門氏菌和副溶血性弧菌均為食品中重要的致病菌,研究其共增菌技術對于控制其疾病的傳播及預防相應的食物中毒具有重大意義。

目前國內外研究中,涉及多種致病菌共增菌培養基的研究已有:沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的共增技術[9],沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的共增技術[10],沙門氏菌、大腸桿菌和單增李斯特氏菌的共增技術[11],沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特氏菌的共增技術[12]等,其中大部分培養基選擇性增菌能力不強,不能滿足對目標菌進行富集的要求。翁思聰等[13]研究了一種選擇性富集沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌共增菌培養基,由于其共增菌的菌株種類較多,菌株間存在較為復雜的抑制和共生關系,容易影響檢出效率和重復率。沙門氏菌和副溶血弧菌均為革蘭氏陰性菌,需氧或兼性厭氧,營養需求不高,且兩種細菌均可利用葡萄糖、檸檬酸和甘露醇作為碳源,因此可在同種培養條件下迅速生長,兩者在同一選擇性增菌環境中共增菌具有現實的可行性,且更具有針對性。

本實驗對富集沙門氏菌和副溶血性弧菌兩種引起食源性疾病致病菌的共增菌培養基進行了研究,對其增菌效果進行了初步的評估驗證,并根據目標菌不同的營養需求,篩選適宜抑制劑和促進劑,進行單因素實驗,確定共增菌培養基的配方,最后驗證該培養基的增菌效果,以得到具有較優增菌效果的共增菌培養基,為今后檢測方法的修訂提供必要的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙門氏菌(Salmonellaenteritidis，Se)CMCC 15611、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus，Vp)ATCC 13847 均為本研究室保藏;營養肉湯、營養瓊脂培養基 分析純,用于食品及其他物品檢驗中的菌落計數(上海疾控)上海華康科技開發公司；木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂(Xylose lysine deoxycholate agar,XLD) 分析純,用于沙門氏菌的選擇性分離，北京陸橋技術有限責任公司;硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar,TCBS) 分析純,用于致病性弧菌的選擇性分離，青島高科園海博生物技術有限公司;蛋白胨 分析純，生工生物工程(上海)股份有限公司;磷酸氫二鉀、檸檬酸鈉(Na3C6H5O7·2H2O)、硫代硫酸鈉(Na2S2O3·5H2O)、氯化鈉、葡萄糖、甘露醇 分析純，國藥集團化學試劑有限公司;牛膽鹽 分析純，廣東環凱微生物科技有限公司。

THZ-300恒溫培養搖床、THZ-300隔水式培養箱9270 上海一恒科技有限公司;InoLab pH730臺式pH測量儀 德國WTW公司;UV-1100型紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基礎培養基的選擇 參照沙門氏菌、副溶血性弧菌在食品安全國家標準GB 4789.4-2016及GB 4789.7-2013中規定的增菌培養基配制方法,分別列出其中的成分及含量,參考劉園園等[12]方法,去除培養基中具有選擇性的組分,并根據兩種細菌生長所必要的成分確定共增菌培養基的基礎成分。

1.2.2 共增菌培養基中單因素成分的篩選 根據兩種細菌營養需求和抑制條件的不同,參考之前的研究[11-12]和兩種目標菌各自選擇培養基中的特異成分,篩選不同的抑制劑和促進劑進行實驗。將添加成分列為:葡萄糖、檸檬酸鈉、硫代硫酸鈉、甘露醇、氯化鈉、牛膽鹽。根據方法1.2.1配制基礎培養基,取四支試管編號1～4號,其中1號試管作為空白對照,只加入基礎培養基4 mL,2、3、4號試管分別加入含低濃度、中濃度、高濃度添加成分的基礎培養基4 mL(見表2),分裝后高壓滅菌備用。將沙門氏菌和副溶血性弧菌分別接入不同添加成分的培養基中,在37 ℃,120 r/min下搖床振蕩培養24 h,用紫外可見分光光度計測定在600 nm波長處的光密度OD值,以此確定適宜添加成分及適宜添加量,制備共增菌培養基。

1.2.3 目標菌增菌效果的驗證 以102CFU/mL作為目標菌初始接種量,將沙門氏菌及副溶血性弧菌分別接種至共增菌培養基中,于37 ℃搖床中振蕩培養24 h。分別取0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h時的菌液1 mL,加入9 mL生理鹽水中,制成1∶10稀釋液,以此類推,分別進行適宜梯度稀釋,每個梯度平行三次,平板涂布至XLD及TCBS培養基中,置于37 ℃培養箱中培養24 h,對平板進行菌落計數,并乘以對應的稀釋倍數,得出總菌落數,繪制目標菌生長曲線并分析結果。由于營養肉湯沒有特定選擇性,且沙門氏菌和副溶血性弧菌均可在營養肉湯中生長,故以營養肉湯增菌液作為對照組,重復上述操作,得出對照組生長曲線。并以102CFU/mL為初始接種量,將沙門氏菌及副溶血性弧菌以1∶1比例一同接種至共增菌培養基中,于37 ℃搖床中振蕩培養24 h并稀釋涂布平板,觀察目標菌生長情況并計算菌落總數,實驗平行三次,同樣以營養肉湯作為對照組,驗證培養基共增菌效果。

1.3 數據處理

利用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進行數據統計,對培養基不同成分添加后目標菌的生長情況進行單因素顯著性差異分析,對目標菌在共增菌培養基及對照組中的增菌情況進行配對T檢驗,進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 基礎培養基的篩選

根據GB 4789.4-2016及GB 4789.7-2013,對目標菌增菌培養基成分進行比較,結果如表1所示。由表1分析可知,蛋白胨為沙門氏菌和副溶血性弧菌提供氮源和能源,參照國標，其含量取10.0 g為宜,氯化鈉在增菌液中起到調節滲透壓的作用,而磷酸二氫鉀的添加可以穩定菌體生長過程中pH的變化[10],綜合考慮兩種目標菌的基本生長條件及配制簡便性,取氯化鈉5.0 g,磷酸氫二鉀1.5 g為適宜含量,得出共增菌培養基的基礎成分為:蛋白胨10.0 g,磷酸二氫鉀1.5 g,氯化鈉5.0 g,蒸餾水1000 mL。將以上成分進行分裝,振蕩搖勻,調節pH至7.2～7.4,于1×105Pa高溫滅菌15 min后置于4 ℃保存備用。

表1 目標菌增菌培養基成分比較Table 1 Comparison of enrichment medium compositions of target bacteria

2.2 共增菌培養基添加成分及含量

添加抑制劑和促進劑的增菌液按濃度從低到高進行排列,成分及添加濃度如表2所示。

表2 各添加成分及其添加量Table 2 Additive amount of different candidate agents

將目標菌接種培養后,在基礎培養基中培養24 h后,沙門氏菌的OD600值為0.523±0.014,副溶血性弧菌的OD600值為0.332±0.007,以此作為空白對照。在添加不同成分的基礎培養基中培養24 h后,兩種目標菌的OD600值如表3所示。

表3 各添加成分對兩種目標菌生長的影響Table 3 Effect of different candidate agents on the growth of two target bacterias

對抑制劑單因素實驗的結果顯示,硫代硫酸鈉的添加對沙門氏菌和副溶血性弧菌的生長均起到明顯的作用。當硫代硫酸鈉的添加量不大于5.0 g/L時,沙門氏菌受到顯著促進作用,而副溶血性弧菌受到顯著抑制作用(p<0.05),當硫代硫酸鈉添加量達到10.0 g/L時,沙門氏菌和副溶血性弧菌均受到顯著的抑制作用,綜合考慮,硫代硫酸鈉的適宜添加量為5.0 g/L。不同濃度的氯化鈉對兩種目標菌的作用不同。對于沙門氏菌而言,氯化鈉濃度越高,對其生長的抑制作用越強,而氯化鈉濃度為2%～4%時,對副溶血性弧菌的生長最為適宜[15]。當氯化鈉添加量為2.5 g/L時,由于基礎培養基中已添加5.0 g/L氯化鈉,此時氯化鈉的總濃度為7.5 g/L,沙門氏菌OD值為0.703±0.013,副溶血性弧菌為0.721±0.009,兩種目標菌的生長較對照組顯著增加(p<0.05);但當氯化鈉添加量為5.0 g/L,總濃度達10.0 g/L時,沙門氏菌的OD值降到0.450±0.008,其生長受到顯著抑制(p<0.05),由此可知,為了使沙門氏菌和副溶血性弧菌在相同增菌時間內均達到檢測限,氯化鈉濃度不能達到副溶血性弧菌最適濃度,適宜添加量為2.5 g/L。牛膽鹽作為一種革蘭氏陽性菌的生長抑制劑[16],在0.1 g/L以下的濃度時,對沙門氏菌和副溶血性弧菌等革蘭氏陰性菌生長的影響不大,但高于此濃度會使抑制作用顯著增強(p<0.05),因此0.1 g/L為牛膽鹽的適宜添加量。

對促進劑單因素實驗的結果顯示,檸檬酸鈉在1.25～2.5 g/L濃度范圍內,可以促進沙門氏菌和副溶血性弧菌的生長,但當添加量達到5.0 g/L時,其促進作用不顯著(p>0.05),表明檸檬酸鈉的促進作用有限,其適宜添加量為2.5 g/L。在1.25～5.0 g/L濃度范圍內,相較對照組,甘露醇對沙門氏菌和副溶血性弧菌有顯著的促進作用(p<0.05)。當添加量為5.0 g/L時,甘露醇對沙門氏菌仍有顯著的促進作用(p<0.05),但對副溶血性弧菌的促進作用不顯著(p>0.05)。葡萄糖作為一種碳源,其添加對兩種細菌的生長均可起到一定程度的促進作用[17],根據表中結果分析,葡萄糖最適宜的添加量為2.5 g/L,此濃度對沙門氏菌和副溶血性弧菌的促進效果均顯著。

綜上所述,最終確定共增菌培養基的添加成分及其含量為:蛋白胨10.0 g、磷酸二氫鉀1.5 g、氯化鈉7.5 g、硫代硫酸鈉5.0 g、牛膽鹽0.1 g、檸檬酸鈉2.5 g、甘露醇2.5 g、葡萄糖2.5 g、1000 mL蒸餾水。配制后充分混勻,調節pH為7.2～7.4。將該培養基命名為SV(Salmonella-Vibrioparahaemolyticus)富集培養基。

2.3 目標菌在共增菌培養基中增菌效果的驗證

沙門氏菌和副溶血性弧菌在SV培養基和營養肉湯培養基(對照組)中分別增菌的結果如圖1和圖2所示。

圖1 沙門氏菌在營養肉湯(對照) 和SV增菌液中24 h內生長情況Fig.1 Growth of Salmonella in nutritional broth(control)and SV broth within 24 h

圖2 副溶血性弧菌在營養肉湯(對照) 和SV增菌液中24 h內生長情況Fig.2 Growth of Vibrio parahaemolyticus in nutritional broth and SV broth within 24 h

由圖1可知,較高氯化鈉濃度造成的高滲環境對沙門氏菌的生長起到抑制作用,沙門氏菌在SV培養基中的生長速率略慢,生長對數期相對于對照組滯后。

表4列出了沙門氏菌在兩種培養基中每4 h時的菌濃度,由表中數據分析可知,在SV培養基中培養16 h時,沙門氏菌達到最高生長濃度可達108CFU/mL,與對照組109CFU/mL存在顯著性差異(p<0.05),表明沙門氏菌在SV增菌液中增菌效果低于對照組。

表4 沙門氏菌在營養肉湯(對照)和SV增菌液中生長差異性比較Table 4 Comparison of Salmonella growth differences in nutritional broth(control)and SV broth

與沙門氏菌相比,副溶血性弧菌受到鹽濃度的抑制作用較小,由圖2可知,副溶血性弧菌在SV培養基中培養時,約2 h就能進入對數期,且在增菌10 h時菌濃度達到最高值,相比對照組增效明顯,表明SV增菌液比對照組更適于Vp。

表5中數據顯示,在4、8 h時,SV培養基中的菌液濃度同對照組比,存在顯著性差異(p<0.05),當增菌時間到達16 h時,SV增菌液和對照組中菌液濃度均達到109CFU/mL,差異不顯著性(p>0.05),表明副溶血性弧菌在SV增菌液中增菌效率比對照組高。

表5 副溶血性弧菌在營養肉湯(對照)和SV增菌液中生長差異性比較Table 5 Comparison of Vibrio parahaemolyticus growth differences in nutritional broth(control)and SV broth

將沙門氏菌及副溶血性弧菌以1∶1比例一同接種至SV培養基及營養肉湯中,經過24 h增菌培養后,沙門氏菌菌落總數可達到107CFU/mL,副溶血性弧菌菌落總數可達到108CFU/mL(見圖3),相比對照組,沙門氏菌在增菌24 h后菌濃度可達到107CFU/mL,而副溶血性弧菌在增菌24 h后菌濃度為106CFU/mL,表明SV培養基對沙門氏菌和副溶血性弧菌的共增菌效果優于營養肉湯。較翁思聰等[13]研究結果中,沙門氏菌和副溶血性弧菌在SV培養基中共同增菌時生長更為旺盛,可達到后續檢測的檢測限。

圖3 沙門氏菌和副溶血性弧菌在SV培養基 及對照組中共增菌生長情況Fig.3 Simultaneous growth of Salmonella and Vibrio parahaemolyticus in SV broth and control broth

3 討論與結論

本研究通過對GB 4789.4-2016及GB 4789.7-2013中沙門氏菌和副溶血性弧菌選擇性增菌液成分的篩選以及兩種目標菌營養需求的分析配制了合適的基礎增菌液,并對共增培養基中促進劑和抑制劑進行了篩選,最終配制出可同時富集沙門氏菌和副溶血性弧菌的共增菌SV培養基。本研究中的兩種目標菌均為革蘭氏陰性細菌,因而在設計SV培養基時,添加了硫代硫酸鈉、牛膽鹽等革蘭氏陽性菌抑制劑,同時添加適宜濃度的氯化鈉,使兩種目標菌能以相對一致的速度生長。檸檬酸鈉、甘露醇、葡萄糖等可作為細菌的生長因子,對沙門氏菌和副溶血性弧菌的生長起到促進作用。本研究中對照組營養肉湯NB為通用型肉湯培養基,無法實現幾種目標菌的共同增菌[18],且國標中各個菌株的選擇性增菌液只能滿足單一菌種的增菌,而SV培養基可同時對沙門氏菌和副溶血性弧菌兩種目標菌進行富集,成分相對簡單,配制簡易,針對性較強。同時可在此基礎上進一步研究目標菌的多重PCR等技術,實現快速檢測的需求。

本研究結果表明,研制出用于沙門氏菌和副溶血性弧菌的共增菌培養基成分為:蛋白胨10.0 g,磷酸二氫鉀1.5 g,氯化鈉7.5 g,硫代硫酸鈉5.0 g,牛膽鹽0.1 g,檸檬酸鈉2.5 g,甘露醇2.5 g,葡萄糖2.5 g,蒸餾水1000 mL。當目標菌初始濃度為102CFU/mL時,將沙門氏菌與副溶血性弧菌以1∶1比例接種至SV培養基中,37 ℃培養24 h后,菌濃度可分別達到107CFU/mL和108CFU/mL,其共增菌效果優于營養肉湯。本研究研制的SV共增菌培養基可同時富集沙門氏菌和副溶血性弧菌兩種目標菌,滿足目標菌檢測的要求,且增菌培養基成分相對簡單,成本較低,具有良好的市場前景,也為今后檢測方法的修訂提供了一定的依據。