苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的 合成及抑菌性能研究

于沛沛,王 斌,李婧茹,姜啟興,許艷順,劉曉麗,楊 方,夏文水

(江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

N-乙酰氨基葡萄糖(N-Acetyl-D-Glucosamine,NAG)作為葡萄糖的一種衍生物,在自然界中廣泛存在,尤其在甲殼類動物的外骨骼中含量最高。它是合成雙歧因子的重要前體,在生物體內具有許多重要生理功能,屬于功能性氨糖類化合物,廣泛應用于醫藥領域,食品配料以及化妝品等[1-2]。

苯甲酸是我國常用的食品防腐劑之一,在酸性條件下,對細菌和真菌都具有較強的抑制作用。因苯甲酸需要以分子的形式發揮抑菌作用,中性條件下，苯甲酸的羧基會發生電離,從而使其失去抑菌活性。苯甲酸不僅在中性條件下抑菌效果差,還存在疊加中毒現象,在使用上有爭議,而且在一些國家的進口食品中受到限制,應用范圍越來越窄[3-4]。N-乙酰氨基葡萄糖上有大量的羥基,如果把其作為多元醇,和具有抑菌活性的苯甲酸發生酯化反應,理論上既可以降低苯甲酸的毒性,又因苯甲酸基團的羧基生成酯鍵,在中性條件下不會發生電離,其抑菌效果可能受pH的影響不大。因此，開發苯甲酸酯化物對改善其中性條件下的抑菌效果，具有重要的現實意義。

本文通過酯化反應合成具有抑菌功能團的苯甲酸乙酰氨基葡萄糖衍生物,以期降低苯甲酸的毒性,擴大抑菌譜,彌補苯甲酸只在酸性條件下才有抑菌性的不足,使其可以在更寬的pH范圍內使用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

N-乙酰氨基葡萄糖 南通雙林生物制品有限公司;大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae) 江南大學食品學院微生物實驗室;甲磺酸、苯甲酰氯、氨水、無水乙醚 分析純,中國醫藥集團上?；瘜W試劑公司。

SPX 型智能生化培養箱 南京實驗儀器廠;ZK-82B型電熱真空干燥箱 上海試驗儀器有限公司;5DDXB FT-IR型紅外光譜儀 美國 Nicolet公司;DF-101SA-H型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 南京科爾儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的合成及純化 準確稱取干燥至恒重的N-乙酰氨基葡萄糖2.21 g于250 mL三頸燒瓶中,加入15 mL甲磺酸,0 ℃下以900 r/min速度攪拌30 min,至N-乙酰氨基葡萄糖完全溶解。加入4.8 mL苯甲酰氯,繼續攪拌3 h,反應結束后,產物于-18 ℃下靜置2 h。將產物傾倒于500 mL冰水中,抽濾,得乳白色顆粒狀固體。將濾餅置于500 mL去離子水中,磁力攪拌至產物均勻分散于水中,用1 mol/L的氨水調pH至7.0。抽濾,將濾餅用乙醚洗滌,至乙醚洗液中檢測不出苯甲酸為止。抽濾,真空度90 KPa,溫度70 ℃下，真空干燥得乳白色粉末狀產物,即為苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯。

1.2.2 反應物配比對產物取代度的影響 在合成反應中,保持反應液溫度0 ℃,反應時間3 h,將反應物(苯甲酰氯/N-乙酰氨基葡萄糖)摩爾比分別設為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1進行試驗,通過高效液相分析,研究反應物摩爾比對產物各酯含量的影響。

1.2.3 合成產物的紅外光譜分析 取反應溫度0 ℃、時間3 h、反應物摩爾比4∶1下制得的苯甲酸殼聚糖酯樣品100 μg,在4000～400 cm-1范圍內記錄其紅外光譜圖。

1.2.4 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的液相圖譜分析 取苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯樣品100 μg,進行高效液相檢測。色譜柱為BEH C-18柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),用0.2%的甲酸溶液和乙腈進行梯度洗脫,洗脫條件為:0 min甲酸/乙腈(100∶0,v/v),15 min甲酸/乙腈(50∶50,v/v),20 min甲酸/乙腈(0∶100,v/v)。流速0.3 mL/min,柱溫30 ℃,采用WATERS ACQUITY PDA檢測器,在波長280 nm處進行檢測,進樣量為5 μL[5-6]。

1.2.5 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的質譜分析 取苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯樣品100 μg,采用質譜分析儀進行結構鑒定[6]。質譜條件:離子方式ESI-,毛細管電壓3 kV,錐孔電壓30 V,離子源溫度100 ℃,脫溶劑氣溫度250 ℃,質量范圍100～3000 m/z,光電倍增器電壓1600 V,氣體流速50 L/h。

1.2.6 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的物理性質測定

1.2.6.1 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯熔點的測定 取苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯樣品1 mg,用毛細管法測定其熔點[7]。

1.2.6.2 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯溶解性的測定 準確稱取經干燥至恒重的苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯樣品1.0 g于50 mL燒杯中,室溫下分別加入乙醇、乙醚、乙酸、丙酮、乙酸乙酯,攪拌使其充分溶解,過濾,沉淀經真空干燥(干燥溫度30 ℃,干燥時間3 h,真空度90 KPa)后稱重,樣品在溶劑中的溶解度可由已溶解樣品的百分量來確定[8]。

1.2.7 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯抑菌作用的影響因素

1.2.7.1 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯濃度對其抑菌作用的影響 選取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉四種受試菌種,將苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯樣品溶解在乙酸乙酯溶液中,使其濃度分別為0.5、1、1.5、2、2.5 mg/mL,在pH6.5時,用平板菌落計數法測定其抑菌率[9]。

1.2.7.2 pH對苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯抑菌作用的影響 選取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉四種受試菌種,將苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯溶解在乙酸乙酯溶液中,濃度為1 mg/mL,分別在pH3.5、4.5、5.5、6.5和7.5時,用平板菌落計數法測定其抑菌率[9]。

1.2.8 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯對受試菌種抑菌直徑的測定 選取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉四種受試菌種,將苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯樣品溶解在乙酸乙酯溶液中,濃度為1 mg/mL,分別在pH3.5、4.5、5.5、6.5和7.5時,用濾紙片抑菌圈法測定其抑菌效果,同時做苯甲酸和N-乙酰氨基葡萄糖的對照試驗[10]。

1.2.9 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯對受試菌種最小抑菌濃度(MIC)的測定 選取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉四種受試菌種,將不同濃度的苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯樣品溶解在乙酸乙酯溶液中,在pH3.5、4.5、5.5、6.5和7.5時測定其MIC,同時做苯甲酸和N-乙酰氨基葡萄糖的對照試驗[11]。

2 結果與分析

2.1 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的合成路線

將N-乙酰氨基葡萄糖與苯甲酰氯進行酯化,甲磺酸在反應中作催化劑,反應取決于N-乙酰氨基葡萄糖羥基對苯甲酰氯的親核進攻[12]。由于位阻效應,與亞甲基相連的羥基反應活性更大,因此親核進攻主要發生此位點,但N-乙酰氨基葡萄糖是椅式結構,其它羥基的位阻效應也不是很大,當反應物苯甲酰氯量小時,與亞甲基相連的羥基會優先發生反應,而苯甲酰氯過量的情況下,每個羥基都有可能發生酯化反應,其合成路線見圖1。

圖1 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的合成路線Fig.1 The synthetic route of benzoyl NAG ester

2.2 反應物配比對各酯含量的影響

從圖2中可以看出,隨著反應物配比的增加,產物的酯化度升高,出現了單酯、二酯、三酯、四酯等不同的酯化產物。單酯的最佳反應物配比為1∶1;二酯的最佳反應物配比為2∶1;三酯的最佳反應物配比為4∶1;四酯的最佳反應物配比為5∶1。N-乙酰氨基葡萄糖雖為小分子物質,且由于其椅式結構,空間位阻效應不大,但是要得到較高得率的四酯，仍然比較困難,從圖中也可以看出,反應物配比從5∶1上升至10∶1時,四酯的含量基本不變。實驗發現,單酯、二酯在水和大多數有機溶劑中都具有很好的溶解性,洗脫提純時很容易損失掉,因此本文合成反應的主要產物為三酯。

圖2 反應物配比對各酯含量的影響Fig.2 The effect of reactant ratio on the content of each ester

2.3 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的紅外圖譜

將純化后的苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯進行紅外光譜分析,結果見圖3。圖中1725 cm-1和1267 cm-1出現的強吸收峰,分別歸屬于C=O的吸收和C-O-C伸縮振動,表明有酯鍵生成,1400～1600 cm-1之間的吸收峰為苯環的伸縮振動所致,3400 cm-1處羥基的特征吸收峰幾乎消失,表明有大量的羥基參與酯化反應[13]。

圖3 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的紅外圖譜Fig.3 FTIR spectrum of benzoyl NAG ester

2.4 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的液質聯用圖譜

本研究采用HPLC法對苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯進行梯度洗脫,洗脫液由0 min 100%的甲酸溶液(0.2%)到20 min 100%的乙腈。圖4為純化后的苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的HPLC圖譜,主峰保留時間為2.49 min,含量占89.95%,副峰保留時間為3.15 min,含量占6.35%。圖5為純化后的苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的MS圖譜。負離子質譜圖(ES-)中出現的534峰為[M+H],苯甲酸乙酰氨基葡萄糖三酯的分子量533與質譜信號相吻合,故可以認為2.49 min出峰的物質為苯甲酸乙酰氨基葡萄糖三酯;負離子質譜圖(ES-)中出現的556峰為[M+Na],故可以認為3.15 min出峰的物質同為苯甲酸乙酰氨基葡萄糖三酯,為2.49 min出峰物質的同分異構體,兩種三酯的總含量約為97%。由此可見,反應溫度0 ℃,反應時間3 h,反應物(苯甲酰氯/N-乙酰氨基葡萄糖)摩爾比4∶1時，合成的產物主要為苯甲酸乙酰氨基葡萄糖三酯。

圖4 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的液相圖譜Fig.4 The HPLC of benzoyl NAG ester

2.5 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的物理性質分析

2.5.1 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的熔點 毛細管法測得N-乙酰氨基葡萄糖和苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的熔點。N-乙酰氨基葡萄糖的熔點為197～198 ℃,這與文獻值相符[14],苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的熔程范圍為171～175 ℃。苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的熔程變寬與樣品的純度有關,而熔點的下降與其分子結構有關。因為酯化反應后,?；慕尤肫茐牧薔-乙酰氨基葡萄糖的排列規整性,從而導致其熔點下降。

2.5.2 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的溶解性 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯在不同有機溶劑中的溶解度見表1。從表1中可以看出,苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯除在乙醚中基本不溶外,在其它溶劑中的溶解度相差不大。苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯在乙酸乙酯中有較好的溶解性,在我國乙酸乙酯已被批準為食品添加劑[15],故可將產物先溶于乙酸乙酯,再添加至食品中。

表1 N-乙酰氨基葡萄糖、苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的溶解性(g/L)Table 1 Solubility of NAG and benzoyl NAG ester(g/L)

2.6 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯抑菌作用的影響因素

2.6.1 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯濃度對其抑菌作用的影響 抑菌劑濃度,即抑菌劑的添加量,是影響抑菌劑抑菌效果的一個重要因素。一般來說,添加量越高,其分子越多,與微生物接觸的幾率越大,抑菌效果就越好。但是當抑菌劑與微生物之間達到平衡時,再繼續添加就不能增強抑菌效果了。濃度對苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯抑菌作用的影響見圖6。從圖中可以看出,苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的抑菌活性隨濃度的升高逐漸增強,低濃度處出現的異常結果,可能是由于濃度差別太小，抑菌效果分辨不明顯導致,并不能影響整體趨勢[16]。

圖6 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯濃度對其抑菌作用的影響Fig.6 The influence of inhibitory concentration on bacteriostatic action of benzoyl NAG ester

2.6.2 pH對苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯抑菌作用的影響 從圖7可以看出,隨pH由酸性到弱堿性的變化,苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的抑菌效果變化不大。pH變化也是影響抑菌劑抑菌效果的一個重要因素,許多抑菌劑必須在特定pH下才有較好的抑菌性,從而導致使用受限,因此是否具有較寬的pH使用范圍已成為評價抑菌劑性能優劣的一個重要指標。由于苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯無自由氨基,主要靠苯甲酸基團發揮抑菌作用,而苯甲酸基團的羧基已生成酯鍵,在中性條件下不會發生電離,所以其抑菌效果基本不受pH影響。

圖7 pH對苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯抑菌作用的影響Fig.7 The influence of pH value on bacteriostatic action of benzoyl NAG ester

2.7 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯對受試菌種的抑菌直徑及MIC

表2和表3為苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯對四種受試菌種的抑菌效果,從抑菌直徑的比較中可以看出,N-乙酰氨基葡萄糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌無抑制作用,而且在某些pH條件下還會作為糖分被啤酒酵母、黑曲霉所利用,出現促進生長的現象[17];苯甲酸對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果相似,pH≤4.5條件下，苯甲酸有較好的抑菌效果,但pH>4.5條件下，其抑菌活性迅速減弱,至pH6.5時失去抑菌活性,這是因為苯甲酸需要以分子的形式發揮抑菌作用,中性條件下苯甲酸的羧基會發生電離,從而使其失去抑菌活性[18];苯甲酸對啤酒酵母和黑曲霉表現出較好的抑菌效果,在pH3.5條件下，抑菌直徑可達18 mm和17 mm,但pH≥6.5條件下，同對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的作用效果相似,幾乎無抑菌性;合成產物苯甲酸乙酰氨基葡萄酯在所選pH范圍內，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有較好的抑菌活性,在pH≥5.5條件下，抑菌效果優于苯甲酸,測定MIC值得到的結論和以上基本一致。

表2 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯對受試菌種的抑菌直徑Table 2 The inhibition diameter of benzoyl NAG ester against strains

表3 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯對受試菌種的MIC值Table 3 The MIC of benzoyl NAG ester against strains

綜上所述,與其母體N-乙酰氨基葡萄糖無抑菌性相比,合成產物苯甲酸乙酰氨基葡萄酯對受試菌種有良好的抑菌性;與苯甲酸相比,合成產物苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯亦彌補了苯甲酸只在酸性條件下具有抑菌性的不足,在酸性及中性條件下都有較好的抑菌效果。

3 結論

以N-乙酰氨基葡萄糖與苯甲酰氯為原料進行酯化反應,在反應溫度0 ℃、反應時間3 h,苯甲酰氯/N-乙酰氨基葡萄糖摩爾比為4∶1時,經提純得到合成產物主要為三酯。在pH3.5～7.5范圍內對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉的最低抑菌濃度(MIC)范圍分別為2.4～2.6、1.4～1.6、2.0～2.2、1.8～2.0 g/L。與N-乙酰氨基葡萄糖相比,無論在酸性條件還是中性條件下,抑菌效果都明顯優于N-乙酰氨基葡萄糖;與苯甲酸相比,在酸性條件下抑菌效果略低于苯甲酸,在中性條件下明顯優于苯甲酸,苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯亦彌補了苯甲酸只在酸性條件下具有抑菌性的不足,在酸性及中性條件下都有較好的抑菌效果,有望作為一種安全、高效防腐劑廣泛應用于酸性及中性食品中。