固定化馬來酸順反異構酶合成富馬酸

劉文茂 ， 周 麗 ， 周哲敏 *

（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

富馬酸（Fumaric acid）是一種天然存在的四碳平臺有機酸，又稱為反丁烯二酸、延胡索酸，在醫藥、食品、日用化工等領域有著重要的價值[1]。馬來酸 順 反 異 構 酶 （EC 5.2.1.1，Maleate cis-trans Isomerase，MaiA）屬于天冬氨酸、谷氨酸消旋酶超家族[2]，能夠催化馬來酸在碳碳雙鍵不斷裂的情況下異構化生成富馬酸。其中，粘質沙雷氏菌株來源的馬來酸順反異構酶具有轉化率高、pH范圍寬泛、Km值較低等特點，被認為是有望用于工業生產富馬酸的生物催化劑之一[3]。游離酶在用于生物催化反應時，具有穩定性低、回收利用困難、分離成本高等問題；而固定化酶則具有可重復利用，能控制反應過程，熱穩定性好，酶與底物和產物易分離，產物純度高，能降低分離純化成本等優點[4-5]。然而，目前尚無馬來酸順反異構酶固定化以及用固定化馬來酸順反異構酶合成富馬酸的研究報道。

交聯酶聚集體（Cross-linked enzyme aggregates，CLEAs）[6]是一種新型無載體固定化技術，通過在溶液中使酶蛋白分子發生物理聚集，隨后利用常規交聯劑戊二醛[7]對聚集體進行化學交聯，該方法制備過程簡單，但是由于固定化酶全部由酶蛋白組成，其機械強度較差，在實際應用中會暴露出很多問題。一方面，CLEAs的粒徑一般都在10 μm以下，這樣就很難通過簡單地離心或過濾從反應體系中分離和回收CLEAs。另外，CLEAs壓縮阻力很低，離心和過濾后很難重新均勻地分散到反應體系中，使其催化效率下降。

傳統包埋法具有隨機性、包埋效率低、制備過程條件苛刻、時間長、制得的固定化酶顆粒較大導致轉化時傳質阻力大等缺點[8]。通過對硅藻沉淀硅的機理進行研究，發現了硅蛋白（silaffins），并篩選出硅蛋白中可以高效沉淀硅的R5短肽[9]，R5肽段在中性pH及常溫條件下，幾秒鐘內即可體外誘導硅沉淀，形成自包埋結構[10]。 Lai[11]、Chien[12]、Marner[13]等人應用R5肽段在溫和的條件下高效、快速地制備出酶活回收率高、操作穩定性好、熱穩定性好的固定化酶。但是，本研究前期發現R5肽段與酶融合后，直接包埋制得的固定化酶顆粒較小不易回收，并且熱穩定性也較差。而將交聯酶聚集體技術與R5肽段自包埋兩種方法相結合，即可以解決CLEAs機械強度差、易分散等問題，又可以解決R5肽段直接包埋不易回收、熱穩定性差的問題，但目前尚未見類似研究。

本研究利用馬來酸順反異構酶合成菌株E.coli BL21（DE3）/pET-24a（+）-maiA[14]高效表達馬來酸順反異構酶，采用交聯酶聚集體技術與R5肽段自包埋技術相結合的方法，制備熱穩定性好、操作穩定性高的固定化馬來酸順反異構酶（Si-CLEAs）；進一步研究固定化馬來酸順反異構酶的酶學性質，并將其裝入填充床反應器應用于富馬酸的合成。該研究為固定化馬來酸順反異構酶合成富馬酸的工業化應用提供了借鑒。

1 材料與方法

1.1 菌株與引物

基因工程菌株 E.coli BL21（DE3）/pET-24a（+）-maiA、重組質粒 pET-24a（+）-maiA 由本實驗室構建、保藏。

本文所用引物如下：

primer F：

5'-CCATATGTCCTCCAAGAAATCGGGATCCT ACTCGGGATCCAAGGGTTCCAAGCGTCGCATCTTG ATGAGCAACCACTACCGCATCGGCCAGATC-3'；

primer R：

5'-GCTGTCCACCAGTCATGCTAGCCATATGTA TATCTCC-3'。

1.2 主要試劑

Primer star DNA聚合酶，NdeⅠ限制性內切酶，T4 DNA連接酶等：日本寶生物工程（大連）有限公司產品；馬來酸，富馬酸，25%戊二醛：BBI Life Sciences；正硅烷甲酯，磷酸二氫鉀，硅藻土：國藥化學試劑有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 重組菌株誘導表達及純化方法 將菌株E.coli BL21（DE3）/pET-24a（+）-R5-maiA 在 LB 固體平板上劃線活化，挑取LB平板上單菌落，接種至5 mL含 50 μg/mL卡那霉素的 LB培養基中，37℃200 r/min振蕩培養8 h，取500 μL上述培養物接種至50 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養基中，37℃ 200 r/min振蕩培養至菌液OD600達到0.8，加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，20℃誘導20 h。

收集菌體超聲破碎，12 000 r/min離心10 min獲得粗酶液，粗酶液經0.45 μm的濾膜過濾后用1 mL的His Trap FF crude柱對重組蛋白進行純化。

1.3.2 馬來酸順反異構酶酶活測定方法 取100 μL游離馬來酸順反異構酶溶液 （或固定化酶懸浮液），加入50 μL濃度為1 mol/L的馬來酸（KOH調至8.0）溶液，用Na2HPO4-KH2PO4緩沖液將反應體系補加到500 μL，于40℃（固定化酶最適溫度為50℃）保溫10 min。100℃煮沸10 min，離心，取上清液稀釋50倍，測定生成的富馬酸含量。

酶活力單位定義：在上述反應條件下，每分鐘轉化1 μmol底物所需的酶量定義為1 U。

蛋白質定量采用常規的Bradford法[15]。

Na2HPO4-KH2PO4緩沖液：由1/15 M Na2HPO4母液和1/15 M KH2PO4母液按比例配制不同pH緩沖液。

1.3.3 馬來酸和富馬酸的測定方法 馬來酸和富馬酸濃度用高效液相色譜法測定。HPLC檢測條件：色譜柱 Prevail Organic Acid （250×4.6 mm，5 μm ；GraceDavisonDiscoverySciences），流動相為 25mmol/L的K2HPO4溶液pH=2.5，流速 1 mL/min，柱溫40℃，紫外檢測器，波長210 nm，進樣量10 μL。

1.3.4 固定化酶的制備方法 將馬來酸順反異構酶融合酶重組菌株的發酵液離心，獲得菌體，用Na2HPO4-KH2PO4緩沖液清洗，加入適量Na2HPO4-KH2PO4緩沖液重懸菌體至菌懸液的OD600值為35，超聲破碎后離心取上清液，用硫酸銨聚集馬來酸順反異構酶融合酶、戊二醛交聯并用正硅酸甲酯包埋制備固定化酶。具體過程如下：

（1）聚集條件的優化。細胞破碎液中逐步添加硫酸銨粉末，分別至飽和濃度為0～20%、20%～40%、40%～60%、60%～80%、80%～100%，置于 4℃下緩慢攪拌30 min，4℃ 10 000 r/min離心10 min，將每個飽和濃度下的沉淀蛋白均用NaHPO4-KH2PO4緩沖液溶解并透析，通過SDS-PAGE判斷每一濃度梯度下目的蛋白含量，確定最佳硫酸銨添加量。

（2）交聯條件的優化。交聯pH的優化：調節硫酸銨沉淀后蛋白液 pH 分別至 6.5、7、7.5、8、8.7，滴加戊二醛溶液至終體積分數為0.1%，在室溫下攪拌交聯1 h，獲得交聯酶聚集體，對交聯酶聚集體酶活進行檢測，確定最優交聯pH值。

交聯劑戊二醛濃度的優化：調節硫酸銨沉淀后蛋白液pH至7.5，分別加入戊二醛至終體積分數為0.025% 、0.05% 、0.075% 、0.1% 、0.125% 、0.18% 、0.3%、0.5%、0.7%、1%，在室溫下攪拌交聯 1 h，獲得交聯酶聚集體，對交聯酶聚集體酶活進行檢測，確定最優戊二醛添加濃度。

交聯時間的優化：調節硫酸銨沉淀后蛋白液pH至7.5，滴加戊二醛溶液至終體積分數為0.1%，分別在室溫下緩慢攪拌交聯 0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h，獲得交聯酶聚集體，對交聯酶聚集體酶活進行檢測，確定最佳交聯時間。

（3）包埋條件[11]。上述最優條件下獲得的交聯酶聚集體用Na2HPO4-KH2PO4緩沖液洗滌3次，重懸于Na2HPO4-KH2PO4緩沖液中，并且按照硅化反應液∶交聯酶聚集體∶正硅酸甲酯=1∶8∶1 的比例混合（硅化反應液為pH=8的0.1 mol/L磷酸氫二鉀和0.1 mol/L氫氧化鈉的混合溶液；正硅酸甲酯濃度為1 mol/L，用 1 mmol/L 的鹽酸配置）[11]，劇烈攪拌 30 s，靜置離心收集固定化酶Si-CLEAs，并用與細胞破碎液等體積的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液重懸。

1.3.5 馬來酸順反異構酶固定化酶活力的測定將100 μL Si-CLEAs（用粗酶液作為對照）加入到含有100 mmol/L馬來酸鉀的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液中，反應液總體積為0.5 mL，于40℃反應10 min后立即用100℃煮沸10 min終止反應，適當稀釋并用0.22 μm有機濾膜過濾后用高效液相色譜檢測馬來酸和富馬酸的含量，計算出固定化酶的酶活力。

1.3.6 Si-CLEAs的酶學性質 酶促反應最適溫度的測定：Si-CLEAs和游離酶分別在 30、35、40、45、50、55、60 ℃、pH 8.04條件下， 反應 10 min后測定富馬酸含量，并計算酶活。

酶促反應溫度穩定性的測定：Si-CLEAs和游離酶分別在55℃、pH 8.04條件下處理，每小時均取樣品測定測定富馬酸含量，并計算酶活。

酶促反應最適pH的測定：Si-CLEAs和游離酶分別在 pH 為 5.91、6.47、6.98、7.38、7.73、8.04、8.34、9.18以及反應溫度分別為55℃或40℃的條件下，反應10 min后測定富馬酸含量，并計算酶活。

Si-CLEAs的操作穩定性的測定：Si-CLEAs在最適反應溫度和最適反應pH下連續反應8次，測定富馬酸含量并計算酶活力，以第一次反應的酶活力為100%，分別計算相對酶活力。

1.3.7 固定化酶填充床反應器操作過程優化及操作穩定性 將100 mL的固定化酶懸濁液與200 g硅藻土充分混合后填入玻璃柱反應床 （25 cm×3.6 cm，450 mL），利用蠕動泵將底物由下向上泵入反應床中，控制催化溫度40℃。

停留時間對富馬酸生產的影響：將濃度為0.6 mol/L馬來酸鉀作為底物，泵入填充床反應器中反應，并分別控制底物停留時間為0.55、0.67、0.83、1.1、1.67 h，測定富馬酸的產量，計算出富馬酸轉化率和體積轉化速率，確定最適停留時間。

底物濃度對富馬酸生產的影響：在停留時間為0.83 h 的條件下，分別用濃度為 0.2、0.4、0.6、0.8、1 mol/L的馬來酸鉀進行轉化，測定富馬酸的產量，計算出富馬酸的轉化率和體積轉化速率，確定最佳底物濃度。

固定化酶填充床反應器操作穩定性：以優化后的停留時間和底物濃度進行富馬酸連續生產，運行15批次，計算每個批次的底物轉化率，由轉化率的降低程度評估反應器的操作穩定性。

2 結果與討論

2.1 馬來酸順反異構酶融合酶R5-MaiA的克隆、表達

對文獻[9]報道的R5短肽的氨基酸序列進行密碼子優化，獲得適合于大腸桿菌表達的R5短肽基因序列，并根據該基因序列設計引物。用primer F和primer R引物，以攜帶編碼馬來酸順反異構酶基因的重組質粒pET-24a-maiA[14]為模板，反向PCR擴增。將PCR產物用NdeⅠ酶切后自身連接，獲得重組質粒pET-24a-R5-MaiA。重組質粒用NdeⅠ和HindⅢ雙酶切，電泳圖譜獲得5 300 bp和850 bp大小兩條帶；用NdeⅠ和HindⅢ分別單酶切，獲得6 150 bp一條帶 （圖1），表明R5肽段已經成功插入，進一步經DNA測序驗證表明成功構建了重組質粒pET-24a-R5-MaiA。

將重組質粒pET-24a-R5-MaiA轉入E.coli BL21（DE3）中，經誘導表達后，SDS-PAGE 電泳獲得分子量29 000 Da左右的電泳條帶，如圖2所示。

利用重組蛋白C端的His標簽[14]，經1 mL的His Trap FF crude鎳柱純化后 （SDS-PAGE電泳分析結果見圖2），在40℃pH=8.0的條件下測定重組酶R5-MaiA的比酶活為42 U/mg與MaiA的比酶活（48 U/mg）相差不大，表明融合表達R5短肽對MaiA酶活性無顯著影響。

圖1 pET-24a-R5-MaiA質粒酶切驗證電泳圖Fig.1 Identification of pET-24a-R5-MaiA by enzyme digestion

圖2R5-MaiA融合酶表達與純化SDS-PAGE圖譜Fig.2 Expression and purification of R5-MaiA in E.coli

2.2 融合馬來酸順反異構酶固定化酶（Si-CLEAs）的制備

2.2.1 不同硫酸銨飽和度對融合酶（R5-MaiA）沉淀能力的影響 分別用不同體積分數的硫酸銨分級沉淀細胞破碎上清中的游離酶，從圖3可以看出，在0～20%，20%～40%兩個梯度的飽和硫酸銨體積分數下都有大量的R5-MaiA沉淀聚集；當飽和硫酸銨濃度在40%～60%時沉淀聚集的蛋白質中幾乎不再含有R5-MaiA，并且含有大量的雜蛋白；在60%～80%和80%～100%飽和硫酸銨體積分數下R5-MaiA和雜蛋白都很少有聚集沉淀。因此選擇40%的硫酸銨作為聚集沉淀的體積分數。

圖3 硫酸銨分級沉淀SDS-PAGE電泳圖Fig.3 Effect of ammonium sulfate concentration on R5-MaiA precipitation

2.2.2 交聯pH對R5-MaiA交聯酶聚集體（CLEAs）酶活的影響 交聯pH對交聯酶聚集體CLEAs酶活的影響如圖4所示。在磷酸鹽緩沖液pH 7.5的時候CLEAs的酶活最高，這是因為R5-MaiA預測的等電點在7.5附近，在此pH條件下R5-MaiA沉淀較為完全，交聯反應也較充分，所以交聯后酶活回收率也較高，因此選擇7.5作為交聯時的pH值[l1]。

圖4 交聯時pH對CLEAs酶活的影響Fig.4 Effect of cross-linking pH on the relative activity of CLEAs

2.2.3 交聯劑戊二醛的濃度對CLEAs酶活的影響交聯劑戊二醛的體積分數對CLEAs酶活的影響如圖5所示。低體積分數的戊二醛使得反應液中的酶分子交聯程度低，部分游離酶損失且形成的交聯顆粒小導致酶活偏低；隨著戊二醛體積分數的增大，CLEAs的酶活回收率不斷增加，當戊二醛體積分數增加到0.1%時CLEAs的酶活最高；繼續提高戊二醛的體積分數，過度的交聯，導致酶活回收率不斷下降。因此確定交聯時戊二醛的最佳添加體積分數為0.1%。

圖5 戊二醛體積分數對CLEAs酶活的影響Fig.5 Effect of concentration of glutaraldehyde on the relative activity of CLEAs

2.2.4 交聯時間對CLEAs酶活的影響 交聯時間對CLEAs酶活的影響如圖6所示。當交聯時間小于1 h時，隨交聯時間的增加酶活保留逐漸增大，交聯時間過短不能使得酶分子充分交聯，離心沉淀后使得部分游離酶損失；當交聯時間為1 h時，CLEAs的酶活保留達到最高值；當交聯時間大于1 h后，隨著交聯時間的增加，酶活保留逐漸下降，這是由于交聯時間過長導致戊二醛與酶分子過分交聯，破壞了酶分子的構象從而影響了酶活。因此，確定1 h為較適合的交聯時間。

圖6 交聯時間對CLEAs酶活的影響Fig.6 Effect of cross-linking time on the relative activity of CLEAs

在上述最優硫酸銨沉淀條件和戊二醛交聯條件下制備CLEAs的基礎上，進一步利用正硅酸甲酯與R5肽段作用的特性，完成對CLEAs的包埋，即獲得固定化酶Si-CLEAs，并考察該固定化酶的性質。

2.3 馬來酸順反異構酶固定化酶Si-CLEAs的性質

2.3.1 固定化酶最適酶促反應溫度 圖7比較了游離酶與Si-CLEAs固定化酶的最適催化溫度，可見游離酶的最適酶促反應溫度為40℃，而固定化酶的最適酶促反應溫度為55℃。這是由于Si-CLEAs中酶分子是以共價鍵的形式連接在一起，使得CLEAs中的酶分子比游離酶的剛性更強，而在CLEAs外圍包埋的硅也進一步增加了傳熱阻力，因此酶促反應的發生就需要更多的能量，才可以使酶分子活性中心與底物結合發揮催化作用。

圖7 固定化酶與游離酶最適反應溫度Fig.7 Optimun reaction temperature of Si-CLEAs and R5-MaiA

2.3.2 固定化酶熱穩定性 游離酶經過固定化后熱穩定性通常會有所提高[16]，實驗比較了游離酶和3種固定化酶在相同溫度下的熱穩定性，結果如圖8所示。隨著儲存時間的延長，游離酶和固定化酶的酶活性均呈現下降的趨勢，并且可以看出游離酶活性下降的速度要明顯比固定化酶快，游離酶在55℃下的半衰期為0.5 h，直接包埋的固定化酶Si-R5-MaiA和交聯酶聚集體CLEAs在55℃下的熱穩定性均有提高，而固定化酶Si-CLEAs在55℃下的熱穩定性最好，半衰期為4 h，因此，Si-CLEAs這種固定化方法有效提高了馬來酸順反異構酶的熱穩定性。

2.3.3 固定化酶最適酶促反應pH 固定化酶的最適pH除與載體和產物性質有關外，還會受到其他因素的影響。游離酶經過固定化后其最適酶促反應pH值通常發生變化，且很難預測。由圖9所示，在經過固定化后，固定化酶的最適酶促反應pH為7.3，與游離酶相比（最適反應pH為8.0）略向酸性方向偏移。

圖8 3種固定化酶與游離酶熱穩定性的比較Fig.8 Stability of CLEAs，Si-R5-MaiA，Si-CLEAs and free R5-MaiA at 55℃

圖9 固定化酶與游離酶的最適反應pHFig.9 Optimun pH of Si-CLEAs and R5-MaiA

2.3.4 固定化酶Si-CLEAs的重復使用性 固定化酶這一技術的主要目標就是制備能夠重復多次使用的生物催化劑，所以固定化酶的操作穩定性是評判固定化方法的一個重要指標，并且能夠影響生產成本。對3種固定化酶 Si-CLEAs，Si-R5-MaiA，CLEAs進行操作穩定性實驗，結果如圖10所示，Si-CLEAs在經過8個批次的重復使用后依然保留78%的酶活，其酶活保留高于CLEAs和Si-R5-MaiA，固定化酶Si-CLEAs具有良好的重復使用性。

圖10 固定化酶的重復使用性Fig.10 Effect of reusability on relative activity of Si-R5-MaiA，CLEAs and Si-CLEAs

2.4 固定化酶Si-CLEAs在富馬酸合成中的應用

進一步將馬來酸順反異構酶固定化酶裝入填充床反應器，以馬來酸為底物合成富馬酸，并對反應條件進行優化。

2.4.1 停留時間對填充床反應器生產富馬酸的影響停留時間是底物催化的一個重要參數，停留時間由泵入底物的流速和反應器體積大小決定，本實驗通過調節底物的流速來控制停留時間。由圖11可知，富馬酸的轉化率隨停留時間的增加而增加，體積轉化速率隨時間的增加先增加后減少。低的停留時間雖然節約了時間但是不利于底物轉化，而高的停留時間則會導致生產周期長、增加生產成本。因此綜合考慮，選擇50 min作為最佳停留時間。

圖11 停留時間對填充床反應器生產富馬酸的影響Fig.11 Effect of residence time on the production of fumarate in a packed-bed reactor

2.4.2 底物濃度對填充床反應器生產富馬酸的影響 底物濃度對富馬酸生產的影響如圖12所示，在最佳停留時間下，轉化率隨底物濃度的增加而降低，體積轉化速率在較低濃度下很低，在中高濃度下體積轉化速率維持在較穩定的水平；停留時間為50 min的條件下，此固定化酶填充床反應器可完全轉化的最佳底物濃度為0.3 mol/L，此時填充床反應器的催化效率最高。

圖12 底物濃度對填充床反應器生產富馬酸的影響Fig.12 Effect of substrate concentration on the production of fumarate in a packed-bed reactor

2.4.3 填充床反應器生產富馬酸的能力 在實際生產中，為保證富馬酸工業生產的需要，富馬酸的轉化率要保持在95%以上，根據填充床反應器的操作穩定性，需調節底物濃度和保留時間以達到工業生產富馬酸的需要，選擇最佳底物濃度為0.3 mol/L，初始轉化率為99%，在生產10個批次后，富馬酸轉化率依然保持在95%以上（圖13），表明固定化酶反應器能較好的滿足工業化酶法生產富馬酸的需求。

圖13 填充床反應器重復生產富馬酸的能力Fig.13 Reusability of Si-CLEAs in a packed-bed reactor for fumarate production

3 結 語

馬來酸順反異構酶與R5肽端融合表達后，比酶活無顯著降低。以40%的硫酸銨作為沉淀劑，體積分數0.1%的戊二醛作為交聯劑制得的融合馬來酸順反異構酶交聯酶聚集體CLEAs，在經過自包埋處理之后形成固定化酶Si-CLEAs，其酶活回收率為60%。固定化酶的催化最適溫度為55℃比游離酶提高了15℃，有利于實現馬來酸順反異構酶在極端條件下的催化應用；在55℃條件下的半衰期由原來的0.5 h提高到4 h，其熱穩定性有了明顯的提高；在分批進行8個批次的重復催化反應后，保留了78%的初始酶活，顯示出良好的操作穩定性。Si-CLEAs固定化酶裝入填充床反應器以馬來酸為底物生產富馬酸，重復生產10個批次后，仍可保留95%的轉化率。該研究為應用固定化酶Si-CLEAs工業化生產富馬酸提供了借鑒。