osw2對釀酒酵母孢子固定化酶影響的分析

趙 強， 李子杰， 中西秀樹， 高曉冬

（江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122）

釀酒酵母細胞當生長條件比較惡劣，缺乏氮源并在非發酵型的碳源存在下，進行減數分裂，進而產生單倍體孢子[1-2]。釀酒酵母營養細胞壁由兩部分組成[3-4]，從內到外依次是 β-葡聚糖（β-glucan）和甘露糖蛋白（mannoprotein），然而成熟的孢子壁是一個具有四層的層狀結構，由內到外依次是甘露糖蛋白、β-葡聚糖、殼聚糖 （chitosan），以及二酪氨酸（dityrosine）層[5-6]。孢子壁的組裝過程是有序一次組裝的，只有前一層組裝完成，后一層才能開始組裝[7-8]。殼聚糖層和二酪氨酸層的主要作用是增強孢子對外界環境的抵抗能力[9-10]。DIT1基因參與二酪氨酸在胞質中的合成反應即催化L-酪氨酸形成二酪氨酸[11-12]，敲除DIT1基因會導致二酪氨酸層不能形成，因而dit1Δ突變株孢子壁不含二酪氨酸層且最外層為殼聚糖層[13-14]，但是殼聚糖層完整存在[15]。osw2Δ突變株孢子壁雖然具有二酪氨酸層[16-17]，但是卻具有乙醚敏感性，可能是由于OSW2基因的缺失會導致二酪氨酸層的網狀結構大小發生改變[18-19]，具體作用機理目前還未知。

酵母孢子作為固定化酶的載體已經成功被應用，本實驗室之前的研究已經證明osw2Δ突變株孢子是比較優良的固定化酶載體，而OSW2基因的具體功能以及osw2Δ突變株孢子與野生型孢子壁有哪些不同之處目前還不清楚[18]，本研究以α-半乳糖苷酶[20]作為目標蛋白，基于孢子固定化酶催化不同分子量大小底物的活性[21]，找到osw2Δ突變株和野生型AN120孢子壁孔徑大小的不同，并研究孢子壁對不同外界條件處理后的保護性作用。此外研究表明，在不同酵母孢子壁突變體中表達分泌型綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）時，不同突變體會表現出不同的GFP滲漏率，其中ydr326cΔ與osw2Δ相似均具有較低的滲透率，而ydl186wΔ的滲透率稍高一些[22]。本研究選取ydl186wΔ、ydr326cΔ兩種基因缺陷型，并構建osw2Δydl186wΔ和osw2Δ ydr326cΔ雙缺陷型菌株，研究不同突變株孢子固定化酶的催化活性。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

釀酒酵母菌株 AN120，缺陷型菌株 dit1Δ，osw2Δ，ydl186wΔ，ydr326cΔ，osw2Δydl186wΔ，osw2Δ ydr326cΔ，MEL1和 MEL1-3HA表達所用質粒pRS426-TEFpr相關信息見表1，引物相關信息見表2。

1.2 培養基

酵母營養生長與產孢培養基[23]

YPAD培養基：酵母浸出粉10 g，蛋白胨20 g，腺嘌呤30 mg，加水至900 mL，121℃高壓滅菌15 min，培養基冷卻至55℃，加入100 mL單獨滅菌的質量濃度為200 g/L的葡萄糖。

缺陷培養基（SD）：無氨基酵母氮源（YNB）6.7 g，瓊脂粉 20 g（固體培養基），加水至 900 mL，

121℃高壓滅菌15 min，培養基冷卻至55℃，加入100 mL單獨滅菌的質量濃度為200 g/L的葡萄糖和2 g缺少相應氨基酸的氨基酸混合物。

預產孢培養基（YPAce）：酵母浸出粉10 g，蛋白胨20 g，醋酸鉀20 g，加水定容至1 L，121℃高壓滅菌15 min。

產孢培養基（2%KOAC）：醋酸鉀 20 g，加水定容至1 L，121℃高壓滅菌15 min。

大腸桿菌生長培養基

LB培養基：酵母浸出粉5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，加水至 1 L，121℃高壓滅菌15 min。

1.3 試劑與溶液配制

PCR產物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠電泳膠回收試劑盒、質粒小量抽提試劑盒，蜜二糖以及脫脂奶粉購于生工生物工程 （上海）有限公司；DNA連接酶、限制性內切酶購于TaKaRa公司（大連）；棉籽糖購置于J&K百靈威科技；水蘇糖購于阿拉??；β-葡聚糖酶、Percoll梯度離心液、Glucose assay試劑盒購于美國 Sigma-Aldrich公司 （上海）；Anti-HA Mouse mAb 一抗、Anti-βActin Mouse mAb 一抗、Goat-Anti-Mouse IgG，HRP 二抗購于 TRANS；SDSPAGE凝膠配制試劑盒，ClarityTM Western ECL Substrate顯色劑購置于碧云天生物技術研究所。

表1 本研究中所用的菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

DNS試劑：首先溶解6.9 g結晶酚于15.2 mL 10%NaOH溶液中。并用水稀釋至69 mL，在此溶液中加入6.9 g亞硫酸氫鈉；然后稱取255 g酒石酸鉀鈉加到300 mL 10%NaOH溶液中，再加入800 mL 1%3，5-二硝基水楊酸溶液；將上述兩種溶液混合即可[24-25]。

1.4 主要儀器

PCR儀器購于日本takara公司；SDS-PAGE凝膠電泳儀、凝膠成像儀購于美國伯樂公司；紫外分光光度計購于美國GE；冷凍干燥機購于日本EYELA；移液槍、臺式高速冷凍離心機購于德國Eppendorf；nano drop 2000 spectrophotometer購于賽默飛；ImageQuantTMLAS 4000 mini購于美國GE。

表2 本研究中的引物Table 2 Primers used in this study

1.5 質粒和菌株構建

本實驗室已有質粒pRS424-TEFpr-MEL1和pRS424-TEFpr-MEL1-3HA，在此基礎上構建pRS426-TEFpr-MEL1和pRS426-TEFpr-MEL1-3HA。構建方法如下：用SpeⅠ和XhoⅠ雙酶切處理質粒，并將它們連接到經過相同酶雙酶切處理的質粒pRS426-TEFpr上。

osw2Δydl186wΔ 和 osw2Δydr326cΔ 雙重缺陷菌株的構建均是在osw2Δ單倍體的基礎上分別敲除ydl186wΔ和ydr326cΔ獲得相應的雙重缺陷型單倍體菌株，再將對應的單倍體菌株進行融合獲得雙重缺陷型雙倍體菌株。雙重缺陷菌株的具體構建方法如下：以pFA6a-TRP1位模板，分別以HXO294和HXO295，HXO298和HXO299為引物，通過PCR擴增獲得相應的敲除片段，然后將獲得的相應片段通過線性DNA醋酸鋰法轉化osw2Δ4B和osw2Δ16D單倍體釀酒酵母，涂布到選擇性SD-TRP固體培養基進行選擇性培養，挑取轉化子，然后分別以HXO296和 HXO297，HXO300和 HXO301為驗證引 物 ，PCR 驗 證 后 獲 得 osw2Δydl186wΔ 和osw2Δydr326cΔ單倍體菌株，最后將成功敲除的相應單倍體菌株融合為雙倍體菌株osw2Δydl186wΔ（HS9）和 osw2Δydr326cΔ（HS10）。

1.6 α-半乳糖苷酶在釀酒酵母孢子上的表達、固定和純化

將重組質粒pRS426-TEFpr-MEL1分別轉化到釀酒酵母野生型 AN120菌株和 osw2Δ，dit1Δ，osw2Δydl186wΔ，osw2Δydr326cΔ 四 種 缺 陷 型 菌 株中，挑取陽性轉化子在SD-Ura平板上擴培，接種適當酵母陽性轉化子擴培菌株于5 mL SD-Ura液體培養基中，30℃過夜培養，取1 mL過夜培養液轉接至 30 mL YPAce中，30℃搖床培養約24 h（至OD600=1.0），然后 6 000 r/min，離心 1 min 收集酵母細胞，并將菌體轉接至30 mL 2%乙酸鉀產孢培養基中，30℃搖床培養1 d，通過顯微鏡觀察測定產孢率，本實驗所用孢子產孢率均在90%以上。為了獲得單個游離孢子，需進行孢子的子囊破碎與純化，具體操作方法如下：8 000 r/min，1 min收集子囊孢子，并用無菌水洗2次，將收集的子囊孢子重懸于1 mL原生質體緩沖液中（50 mmol/L pH 7.5磷酸緩沖液，1.4 mmol/L 山梨醇，40 mmol/L β-巰基乙醇），之后加入 20 μL Lyticase（1 mg β-葡聚糖酶溶于 500 μL 50% 的甘油中）。 37℃處理 1 h，8 000 r/min，1 min收集所有處理后的孢子，去除上清，沉淀用原生質體緩沖液洗2次，重懸于原生質體緩沖液中，充分混勻，超聲破碎獲得單個游離孢子。將獲得的單個游離孢子用Percoll密度梯度離心的方法進行孢子純化[26]，具體方法如下：首先，孢子經0.5%Triton-X洗滌數次，然后重懸于1 mL 0.5%Triton-X中，將其全部加至Percoll梯度離心液 （從上到下依次為50%，60%，70%，80%Percoll+10%2.5 M 蔗糖和0.5%Triton-X） 最上層，15 000 g，4℃離心 1 h，離心后，去除上面三層，純化的孢子位于最下層，加適量無菌水稀釋后，9 000 r/min離心5 min，棄上清，細胞沉淀經0.5%Triton-X洗滌數次，離心收集細胞。將上述獲得的濕孢子溶于適量無菌水，然后進行冷凍干燥：首先-20℃冷凍預處理約2 h，然后在-50℃，25 Pa下，置于冷凍干燥機EYELA FD-1000處理72 h。經過處理后可獲得干燥的孢子粉末。

1.7 檢測野生型AN120菌株和osw2Δ菌株固定化酶對不同底物的催化效率

α-半乳糖苷酶（Mel1p）催化 α-1，6-半乳糖苷健的水解，本實驗選取3種含有α-1，6-半乳糖苷健且分子大小不同的糖作為底物，蜜二糖（melibiose）、棉子糖（raffinose）、水蘇糖（stachyose），分別屬于二糖、三糖、四糖。這3種糖均能被α-半乳糖苷酶降解，蜜二糖被分解為半乳糖和葡萄糖；棉子糖被分解為半乳糖和蔗糖；水蘇糖被分解為半乳糖和蔗糖。α-半乳糖苷酶酶活測定在2 mL反應體系中進行，反應體系為1 mL 0.2 mol/L HAc-NaAc緩沖液（pH 4.6），1 mL 5% 底物，10 mg孢子。 37℃下反應2 h后，沸水浴10 min終止反應。α-半乳糖苷酶酶活分析檢測用高效液相色譜（HPLC）進行分析，檢測條件為：Bio-Rad Aminex HPX-87C色譜柱（250×4 mm），流動相為超純水，流速為 0.3 mL/min，柱溫為80℃，使用5450示差檢測器。一個酶活單位U定義為：37℃下，1 mg孢子反應10 min所產生的半乳糖的量（mg）。

1.8 游離酶的制備和孢子固定化酶保護性實驗檢測

游離酶制備：轉化有MEL1質粒的野生型酵母菌首先在5 mL SD缺陷型培養基中30℃過夜預培養，然后經30 mL SD缺陷型培養基放大培養，離心收集上清，用Amicon-Ultra超濾管（截留分子量為10 kDa）濃縮至 200 μL，每次實驗取 10 μL。

SDS處理方法介紹如下：稱取10 mg的干孢子粉末，10 μL濃縮蛋白，分別將它們懸浮溶解在1 mL 2%或10%SDS溶液中，然后加入1 mL 5%的底物，37℃下反應2 h，反應完成后沸水浴10 min終止反應。對照組為未經SDS處理，只將其溶解在緩沖液中。

8 mol/L Urea處理方法：收集超聲破碎純化后的單個游離孢子，將其懸浮在1 mL 8 mol/L尿素中處理1 h，對照組在緩沖液中靜止1 h，水洗3次，然后分開進行孢子凍干 （用于固定化酶酶活測定）或8 mol/L尿素提取孢子蛋白 （用于western blot分析蛋白表達量）。

當以蜜二糖為底物時，檢測試劑盒為Glucose assay購買于美國Sigma-Aldrich公司；當以棉子糖為底物時，檢測試劑為DNS試劑（除特殊說明外，本實驗結果均由試劑盒檢測得到）。

1.9 蛋白免疫印跡分析8 M尿素處理對孢子固定化酶的影響

將重組質粒pRS426-TEFpr-MEL1-3HA轉化釀酒酵母AN120野生型與osw2Δ突變株，產孢，收集超聲破碎純化后的單個游離孢子，用8 mol/L尿素處理1 h，收集處理后的孢子，將其懸浮在8 mol/L尿素中，并加入一定量的蛋白酶抑制劑，置于冰上，玻璃珠破碎1 h使孢子完全破碎，孢子內蛋白全部溶解于尿素中，15 000 r/min 4℃，離心30 min，收集上清，nanodrop測定蛋白濃度。上樣量為50 μg蛋白，保證總蛋白量一致，實驗組Anti-HA為一抗，對照組Anti-Actin為一抗，二抗均為Goat-Anti-Mouse IgG，HRP。

2 結果與討論

2.1 雙缺陷型突變菌株的PCR驗證

由于基因敲除片段會有一定的概率插入到染色體的其他位置上，這樣會導致選擇性培養基生長的轉化子有可能是假陽性轉化子，為了避免這種情況的發生，要將轉化子酵母基因組提取出來進行PCR驗證。為了驗證轉化子 osw2Δydl186wΔ和osw2Δydr326cΔ，分別以 HXO296 和 HXO297，HXO300和HXO301為引物，轉化子酵母基因組作為模板，同時以osw2Δ突變株酵母基因組作為對照組模板，通過PCR擴增獲得不同大小的產物，瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示，osw2Δydl186wΔ目的條帶大小為 1 156 bp，對照組為 1 089 bp，osw2Δydr326cΔ 目的條帶大小為1 106 bp，對照組為4 528 bp。

圖1 PCR驗證基因敲除Fig.1 PCR identify of gene knockout

2.2 野生型AN120與osw2Δ突變株酵母孢子壁孔徑大小對比

為了比較野生型AN120和osw2Δ突變株酵母孢子壁的結構差異，分別選取3種分子量大小不同的糖作為底物，HPLC檢測對比兩種孢子對不同底物的催化活性，結果如圖2所示。3種不同底物的孢子固定化酶活檢測均說明osw2Δ突變株酵母孢子固定化酶的活性要高于野生型AN120酵母孢子，但隨著底物分子量的增大，酵母孢子固定化酶的活性隨之降低，野生型AN120與osw2Δ突變株之間孢子固定化酶的活性差異也逐步增大。圖2（b）顯示，當以棉子糖（三糖）為底物時，野生型AN120酵母孢子固定化酶有一定活性，然而，圖2（c）顯示，當以水蘇糖（四糖）為底物時，野生型AN120酵母孢子固定化酶沒有活性，由此可以猜測，野生型AN120酵母孢子壁的結構不能允許四糖大小的底物通過，如果把酵母孢子壁看作是具有一定孔徑的結構，那么野生型AN120酵母孢子壁的的孔徑大小介于三糖和四糖之間。圖2（c）顯示，當以水蘇糖（四糖）為底物時，osw2Δ突變株酵母孢子固定化酶仍然有活性，因此，osw2Δ突變株酵母孢子壁的孔徑大小應大于四糖。

圖2 孢子固定化酶催化不同底物的活性Fig.2 Activity of encapsulated enzyme with different substrates

2.3 孢子固定化酶可抵抗一定濃度SDS的處理

為了研究野生型AN120與osw2Δ突變株酵母孢子對固定化酶的保護性作用，本實驗分別用2%和10%SDS處理孢子固定化酶和游離酶，分別選取蜜二糖和棉子糖為底物來檢測酶的相對活性，將各自未進行處理的酶活作為對照組，活性設為1。以蜜二糖為底物，用2%SDS分別處理游離酶和孢子固定化酶，檢測酶的相對活性，結果如圖3所示。實驗說明，孢子固定化酶幾乎可以完全抵抗2%SDS的處理。以棉子糖為底物，用10%SDS分別處理游離酶和孢子固定化酶，檢測酶的相對活性，結果如圖4所示。實驗說明，孢子固定化酶仍可部分抵抗10%SDS的處理。

2.4 酶活測定與蛋白免疫印跡分析尿素對孢子固定化酶的影響

尿素作為一種小分子物質，更容易進入孢子內，蛋白質中含有肽鍵，尿素中含有酰胺鍵，根據相似相容原理，尿素可以溶解蛋白質。實驗用8 mol/L尿素處理野生型與osw2Δ突變株孢子固定化酶，以蜜二糖為底物，通過葡萄糖測定試劑盒測定固定化酶的活性，結果如圖5所示。實驗說明，osw2Δ突變株孢子固定化酶經8 mol/L尿素處理后，酶活降低80%，而野生型AN120孢子固定化酶經8 mol/L尿素處理后僅降低不足30%，因此猜測8 mol/L尿素更容易進入osw2Δ突變株孢子中，溶解孢子固定化酶。為了驗證這一猜測，進行western blot蛋白免疫印跡實驗，直觀分析孢子固定化酶的含量，結果如圖6所示。經過8 mol/L尿素處理后，osw2Δ突變株孢子固定化酶的含量降低很多，而野生型AN120卻變化不大，結果更進一步說明了8 mol/L尿素可進入osw2Δ孢子內部，溶解固定化酶，降低固定化酶含量，降低酶活。

圖3 2%SDS處理后游離酶和孢子固定化酶的相對活性Fig.3 Relative activity of enzyme after 2%SDS treatment

圖4 10%SDS處理后游離酶和孢子固定化酶的相對活性Fig.4 Relative activity of enzyme after 10%SDS treatment

2.5 多種突變株孢子固定化酶活性測定

為了對比多種突變菌株孢子固定化酶的活性，分別選取蜜二糖和棉子糖為底物進行研究對比，結果如圖7所示。當以蜜二糖為底物時，osw2Δ，ydr326cΔ，osw2Δydl186wΔ，osw2Δydr326cΔ 突變株固定化酶的活性均比較高，差異不大；而當以棉子糖為底物時，osw2Δ，osw2Δydl186wΔ，osw2Δydr326cΔ三個突變株固定化酶的活性明顯高于其他突變株與野生型。綜合考慮，對于催化分子量較大的底物，osw2Δ，osw2Δydl186wΔ，osw2Δydr326cΔ 三個突變株固定化酶催化活性更有優勢。說明這些突變株均能成功固定化酶并具有活性，實驗結果是由試劑盒測定并分析得到，由于測定方法的不同，所以比HPLC測定結果整體偏高，但趨勢均為一致。

圖5 8 mol/L Urea處理后孢子固定化酶的相對活性Fig.5 Relative activity of encapsulated enzyme after 8 mol/L Urea treatment

圖6 8 mol/L Urea處理后osw2Δ孢子固定酶量明顯降低Fig.6 osw2Δ spore encapsulate enzyme decrease significantly

圖5 不同突變株固定化酶的活性Fig.5 Specific activity ofdifferentmutantstrains encapsulate enzyme

3 結 語

本研究將α-半乳糖苷酶成功固定在多種孢子突變菌株上，并著重研究了野生型與osw2Δ突變株固定化酶在對不同底物的催化效率，對外界不良因素的抵抗能力之間的差異等多方面因素，發現了野生型孢子壁最大只允許處于三糖與四糖之間分子量大小的物質通過，而對于osw2Δ突變株孢子壁可以允許四糖或者可能大于四糖的物質通過，在接下來的工作中希望通過嘗試五糖、六糖等更大分子的糖作為底物進行研究，找到osw2Δ突變株以及其他突變株孢子壁結構的最大通過物質。通過8 M尿素處理實驗的結果發現osw2Δ突變株孢子固定化酶的含量下降尤為明顯，目前對于OSW2基因具體影響孢子壁結構的哪一部分還不清楚，后期將會深入研究OSW2基因的具體作用。