細萼連蕊茶花粉生活力和貯藏力研究

常春義 ，鄭奕雄 ，吳華玲 ，崔永春 ，伍嘉倩 ，曾淼林 ，李嘉美，孫映波 ，于 波

（1.廣東省農業科學院環境園藝研究所/農業農村部華南都市農業重點實驗室/廣東省園林花卉種質創新綜合利用重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.仲愷農業工程學院農業與生物學院，廣東 廣州 510225；3.廣東省農業科學院茶葉研究所/廣東省茶樹資源創新利用重點實驗室，廣東 廣州 510640）

細萼連蕊茶（Camellia tsofuiChien）為山茶科山茶屬連蕊茶組灌木，產于我國湖南、江西和四川［1］，樹形緊湊，嫩葉紅色，花小而密集，花瓣背面略帶粉紅色，芳香，可觀形觀花觀葉，可作花境、花壇、叢林及芳香類應用，具有很高的觀賞和園林應用價值［2］。目前，國際登錄的茶花（C.japonica）通?；ㄐ洼^大，重瓣較多、色澤濃艷，樹形壯碩挺拔，葉片硬實濃綠，但極少品種具有濃郁香氣。而連蕊茶組植物（Sect.TheopsisCoh.St.）雖然花朵單瓣、花徑較小、色澤多為白色，葉片較小較薄，樹枝較細偏軟，但花量大，花朵密集，多數種類具芳香氣味，且大多數物種分布于我國境內。因此，利用這些芳香型連蕊茶物種資源與茶花品種進行種間雜交，充分利用雜種優勢改良傳統茶花，實現優勢性狀互補，培育具有芳香氣味的優良茶花新品種是今后茶花育種的重要發展方向。目前，只有少數連蕊茶物種被引種馴化并用于茶花人工雜交育種，包括細萼連蕊茶在內的大多數連蕊茶還未見系統應用于茶花育種研究。

了解連蕊茶花粉生活力和貯藏力的狀況，能夠更好地指導雜交育種工作，解決因花期不育、異地授粉而帶來的授粉困難。目前，已有川鄂連蕊茶和毛柄連蕊茶的花粉低溫貯藏的研究報道［3-4］,但迄今為止未見細萼連蕊茶等其他連蕊茶組植物花粉生活力和低溫貯藏的研究報道。本研究以采自浙江金華的細萼連蕊茶花粉為試材，對其進行了花粉低溫貯藏力和生活力研究，旨在為今后開展細萼連蕊茶與山茶物種間雜交育種提供重要技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2017年1月從浙江金華國際山茶物種園采集即將開放且尚未散粉的細萼連蕊茶花蕾。試驗在廣東省園林花卉種質創新綜合利用重點實驗室進行。將采回的花蕾置于25（±1）℃恒溫下干燥處理12 h。待花藥打開散粉時，收集花粉。先用鑷子將散粉的花藥輕輕取下，放在紙片上，于25（±1）℃恒溫下干燥處放置24 h。然后將花粉連同花藥殼一起分裝到1.5 mL凍存管中，擰緊管蓋，置于-80℃超低溫冰箱保存備用。

1.2 花粉生活力測定

1.2.1 花粉萌發適宜碳源測定 以無糖為對照，分別將含有0.292 mol/L的糖即蔗糖（100.0 g/L）、麥芽糖（105.2 g/L）、葡萄糖（52.6 g/L）、乳糖（100.0 g/L）和山梨醇（52.6 g/L）等5種固體培養基（8 g/L瓊脂，pH 5.5 ～ 6.0）處理滴于載玻片上，用無菌牙簽將新鮮花粉均勻涂布在固體培養基表面。將載玻片置于放有濕潤濾紙的培養盒內，然后將培養盒裝入塑料自封袋密封，置于25（± 1）℃的生化培養箱內，培養24 h 后，于ZEISS正置顯微鏡下觀察統計花粉的萌發率，以確定花粉萌發的最適碳源。

1.2.2 花粉萌發適宜蔗糖濃度測定 設計5種蔗糖濃度處理，分別為0.000、0.146、0.292、0.584、0.876 mol/L，pH 5.5 ～ 6.0。培養 24 h 后，于顯微鏡下觀察并統計花粉萌發率，以確定適合細萼連蕊茶花粉萌發的最佳糖源濃度。

1.2.3 低溫或高溫對花粉萌發效應的測定 模擬華南地區冬春季溫度，將花粉培養分為兩個階段，第一階段設置7個溫度梯度處理，分別為5、15、20、25、30、35、40℃，進行6 h培養處理，模擬夜間低溫或中午高溫，然后轉移至25（±1）℃條件下恢復培養18 h，于ZEISS正置顯微鏡下觀察并統計花粉萌發率，以測試冬季低溫和春季高溫對細萼連蕊茶花粉萌發的影響。上述試驗培養基為100 g/L蔗糖，pH 5.5 ～ 6.0。

統計花粉萌發率時，每個處理重復3次，每個重復觀測100?；ǚ垡陨??；ǚ酃荛L度大于花粉粒直徑作為萌發標準。計算方法為：

1.3 花粉低溫貯藏力測定

將花粉置于-80℃條件下保存，分別貯藏0、3、6、12個月，取低溫處理的花粉按上述1.2探索得到的最適宜條件進行萌發率測定。

1.4 顯微觀察

花粉萌發觀察采用ZEISS正置顯微鏡（Axio Scope A1，德國）。使用AxioVision軟件進行圖像捕捉和保存。

試驗數據使用SAS V8.02軟件進行分析，采用Duncan’s多重比較法進行差異顯著性測驗。

2 結果與分析

2.1 不同碳源處理花粉萌發率比較

本試驗研究了濃度為0.292 mol/L（即100 g /L蔗糖當量）的不同碳源處理對細萼連蕊茶花粉萌發率的影響，調查觀察結果見表1和圖1（封二）。結果表明，以蔗糖和乳糖為碳源處理的花粉萌發率最高，分別為20.07%和19.48%，與其他處理相比差異極顯著；葡萄糖處理次之，為14.42%，與無糖對照差異極顯著；山梨醇處理的萌發率為7.90%，與無糖對照相當；麥芽糖處理的萌發率最低，僅為4.48%，低于無糖對照且差異顯著。

表1 碳源對細萼連蕊茶花粉萌發的影響

2.2 不同濃度蔗糖處理花粉萌發率比較

本試驗還研究了培養基中蔗糖5個濃度梯度處理對細萼連蕊茶花粉萌發率的影響，結果見表2和圖2（封二）。結果表明，當培養基中含有0.292 mol/L蔗糖時，花粉萌發率最高，達20.07%；隨著蔗糖濃度降低或升高，花粉萌發率呈現逐漸遞降趨勢。當蔗糖濃度處理為0.146 mol/L時，花粉萌發率為16.08%；當蔗糖濃度處理為0.000時，花粉萌發率降為7.96%；當蔗糖濃度處理為0.584 mol/L時，花粉萌發率降為13.76%；當蔗糖濃度處理升高到0.876 mol/L時，萌發率僅為3.55%，反映出高濃度蔗糖同樣對花粉萌發產生明顯的抑制效應。

表2 蔗糖濃度對細萼連蕊茶花粉萌發的影響

2.3 低溫或高溫對花粉萌發的影響

本試驗模擬華南地區冬春季溫度，對花粉培養分為兩個階段，研究第一階段的高溫或低溫對細萼連蕊茶花粉萌發率的影響，結果見表3和圖3（封二）。結果表明，將花粉置于5、15、20、25℃環境下培養6 h，再恢復培養18 h，花粉萌發率較高，分別為20.17%、20.21%、20.22%、20.07%，各低溫處理之間差異不顯著。隨著第一階段處理溫度的升高，花粉萌發率顯著降低，當處理溫度為30℃時，花粉萌發率降為14.30%；當處理溫度升高到35℃時，花粉萌發率進一步降低，僅為3.17%；當處理溫度升高到40℃時，花粉完全沒有萌發。

表3 溫度對細萼連蕊茶花粉萌發的影響

2.4 花粉低溫貯藏力測定

花粉-80℃低溫貯藏試驗結果（表4）顯示花粉保存前萌發率為20.07%；貯藏3個月，萌發率為20.33%；隨著貯藏時間延長，花粉萌發率有所下降，貯藏9個月，花粉萌發率降為15.43%；貯藏12個月，花粉萌發率雖然繼續下降，但仍然可達11.54%。

表4 -80℃貯藏細萼連蕊茶花粉萌發率

3 結論與討論

花粉萌發時需要能量物質，花粉自身會貯藏一些淀粉等糖類物質，這些物質能夠促進花粉在適宜條件下啟動萌發。隨著花粉管的伸長，外源的糖類物質將會影響花粉管生長?；ǚ叟囵B使用較為普遍的是蔗糖。前人相似的研究結果表明，蔗糖比果糖和甘露醇更能促進櫻桃花粉的萌發［5］；在野生龍蒿萌發試驗中，蔗糖優于麥芽糖和葡萄糖［6］。但也有不同結論，陳暄等對茶樹花粉萌發的研究表明，麥芽糖優于蔗糖［7］；安國寧等對桃樹花粉萌發的研究則發現，葡萄糖優于蔗糖［8］；許珂等對金銀忍冬花粉萌發的研究則表明，乳糖優于葡萄糖、蔗糖和果糖［9］。因此，在進行某個物種花粉培養時，要先試驗才能確定適宜的碳源。本研究結果表明，蔗糖與乳糖能較好地促進細萼連蕊茶花粉萌發，效果較佳；葡萄糖0.292 mol/L促進花粉萌發效果次之；無糖或山梨醇再次之；麥芽糖最差。值得注意的是，山梨醇0.292 mol/L處理促進花粉萌發的效果與無糖處理差異不顯著，表明作為碳源的山梨醇在此濃度下對花粉萌發促進效果不明顯；麥芽糖0.292 mol/L處理培養基上的花粉萌發率不及無糖處理，說明麥芽糖在此濃度下對花粉萌發不僅不具有促進作用，還具有明顯的抑制作用。

蔗糖不僅提供花粉萌發和花粉管生長所需的能量，同時也能夠維持細胞內外滲透壓。前人研究結果表明，山茶屬多個物種如連蕊茶［3-4］、油茶［10-11］、紅山茶［12-15］、金花茶［16］、茶樹［7，17］的花粉體外萌發所需適宜蔗糖濃度為0.146 ～ 0.584 mol/L，如川鄂連蕊茶為0.584 mol/L ，毛柄連蕊茶為0.292 mol/L。本研究結果表明，細萼連蕊茶花粉體外萌發所需適宜蔗糖濃度為0.292 mol/L，因此，進行連蕊茶組物種的花粉培養試驗時，也要先試驗適宜的糖濃度。

溫度對花粉萌發至關重要。通常，許多植物花粉萌發的適宜溫度為20～28℃［16-18］；但一些植物花粉適宜萌發溫度較高，達30℃［19-20］；而另外有的植物花粉萌發適宜溫度較低，僅為10℃［21］，超過適宜溫度范圍，花粉萌發就會受到不同程度的抑制。本研究模擬華南地區冬春季溫度，對花粉培養分為兩個階段，第一階段設置了7個溫度梯度處理，培養6 h后再轉移至25℃恢復培養，主要目的是為了研究第一階段的高溫或低溫對細萼連蕊茶花粉萌發率的影響。本研究結果表明，第一階段5 ～ 25℃的培養，花粉萌發率較高且差異不顯著，表明低溫對花粉萌發率沒有不良影響。而第一階段30 ～ 40℃的培養，花粉萌發率明顯降低，尤其超過40℃，花粉完全不能正常萌發。因此，在華南地區冬季、春季進行茶花雜交授粉時，不用擔心夜間低溫對花粉的影響；而是要充分考慮中午高溫對花粉萌發的影響。

花粉保存可分為冷藏（4 ～ 5℃）、低溫（-20 ～ -80℃）和超低溫（-196℃液氮）保存等幾種方式。一般來說，冷藏保存可短期內保持花粉活力［3］；低溫保存可較長時間保持花粉活力［22-23］；超低溫保持可長期保持花粉活力［24］，但成本較高。本研究，在-80℃保存1年后，細萼連蕊茶的花粉萌發率仍然達到10%以上，可以解決花期不遇的問題，滿足雜交授粉對花粉活力的需求。

圖1 細萼連蕊茶花粉在不同糖培養基上萌發情況

圖2 細萼連蕊茶花粉在不同濃度蔗糖培養基上萌發情況

圖3 細萼連蕊茶花粉經不同溫度培養處理萌發情況