蕓薹屬AC基因組MTP1基因的生物信息學分析

李施蒙

（西藏自治區農牧科學院農業研究所，西藏 拉薩 850000）

目前，重金屬污染已經成為亟待解決的世界性難題，環境中的重金屬如Pd、Cr等可通過食物鏈的傳遞和富集，最終在人體中累積，破壞正常的生理代謝活動，從而危害人體健康［1］。重金屬鎘（Cadmium, Cd）是天然存在于自然環境中具有極高生物毒性的重金屬元素之一，隨著工業化、城鎮化的迅速發展，我國土壤環境的Cd含量超標狀況日趨嚴重［2］。重金屬鎘離子進入細胞需要相應的轉運蛋白或者離子通道，但鎘不是植物必需的礦質營養元素，因此植物根部對鎘離子的吸收主要依靠Zn、Fe、Mn等與其化學結構相似必需元素的轉運蛋白或通道［3］。對于植物的生長而言，Zn是不可或缺的礦質營養元素，金屬耐受蛋白MTP1（Metal tolerance protein 1）作為一種跨膜蛋白在植物鋅離子轉運過程中起著重要作用。在十字花科植物擬南芥［4］中最先報道的陽離子轉運蛋白（CDF）家族成員MTP1，主要參與鋅離子向細胞外的轉運［5］。

研究發現，CDF家族廣泛存在于細菌、酵母、擬南芥等原核和真核生物中，主要定位于膜體如細菌的細胞膜、植物和酵母的液泡膜以及哺乳動物的高爾基體等膜上［6-7］，具有6個跨膜結構域（Transmembrane domain，TMD）［8］。植物中，擬南芥的AtMTP1基因是研究最透徹的CDF家族蛋白［9］，MTP1蛋白能將鋅離子從細胞質轉移到液泡。隨后蘿卜［10］和水稻［11］中的MTP1基因也相繼被克隆，煙草過表達NtMTP1基因后植株對鋅脅迫的耐受性顯著增強［12］。

目前蕓薹屬中甘藍型油菜耐鎘脅迫的研究［13-14］已有報道，但對MTP1基因的研究卻較少。本研究根據蕓薹屬AC基因組作物的親緣物種擬南芥的MTP1基因序列作為基序，在白菜（Brassica rapa）［15］、甘藍（B.oleracea）［16］、甘藍型油菜（B.napus）［17］3個物種的全基因組數據庫中篩選和鑒定蕓薹屬AC基因組MTP1基因，并從系統進化、基因結構、蛋白理化性質、亞細胞定位和基因組織表達特異性等方面進行分析，旨在為進一步研究蕓薹屬作物中MTP1基因參與鋅離子轉運機制奠定基礎，促進低積累重金屬蕓薹屬作物的種質創新和品種改良。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在擬南芥基因組數據庫（http://www.arabidopsis.org/）中檢索并下載擬南芥MTP1基因的CDS序列。以擬南芥MTP1基因的CDS序列為基序利用蕓薹屬數據庫（http://brassicadb.org/brad/），分別在白菜、甘藍和甘藍型油菜基因組CDS數據庫中進行Blastn搜索（值為1e-100），同時利用在線軟件SMART對下載的擬南芥MTP1蛋白序列和Blast檢索得到的白菜、甘藍和甘藍型油菜MTP1候選基因的蛋白序列進行結構域分析，結合CDF蛋白家族MTP1蛋白序列的結構域特點進一步鑒定蕓薹屬AC基因組中的MTP1候選基因。

1.2 理化性質及亞細胞定位分析

利用在線分析軟件ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）［18］分析蕓薹屬 AC基因組中的MTP1基因和擬南芥MTP1基因編碼蛋白的理化性質，包括分子量（Molecular Weight）、理論等電點（Theoretical pI）、不穩定系數（Instability index）和親疏水性（Grand average of hydropathicity, GRAVY）等。利用軟件Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）對上述MTP1基因編碼的蛋白進行亞細胞定位預測。

1.3 蛋白質二級結構、跨膜結構域、磷酸化位點預測及系統進化分析

利用軟件TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進行蛋白質跨膜結構域分析。利用在線分析軟件Sopma Secondary Structure Prediction Method（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl?page=npsa_sopma.html）對MTP1基因的蛋白質進行二級結構預測。利用 NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）對蛋白質的磷酸化位點進行預測。利用軟件MEGA5.2的鄰近法（neighbor-joining,NJ）［19］，對蕓薹屬AC基因組中MTP1蛋白進行系統進化分析，采用p-distance模型，并設置Bootstrap值為1 000進行校正，構建系統進化樹。

1.4 甘藍型油菜BnMTP1不同組織部位的表達模式分析

使用甘藍型油菜栽培種中雙11的轉錄組數據［20］，提取BnMTP1基因在根、莖、葉、蕾、花和種子等組織部位的表達量FPKM值，比較分析其表達模式。

2 結果與分析

2.1 蕓薹屬AC基因組中MTP1基因家族的鑒定

本研究利用擬南芥AtMTP1基因的CDS序列，通過蕓薹屬數據庫對白菜、甘藍和甘藍型油菜基因組CDS序列進行Blastn同源比對。由于CDF家族中MTP1蛋白含有6個跨膜結構域，對獲得的同源序列再使用SMART軟件進一步鑒定。結果（表1）表明，在白菜基因組中獲得1條序列，位于A03染色體上，命名為BrMTP1A03（Bra000432）；在甘藍基因組中獲得3條序列，均位于C04染色體上，分別命名為BolMTP1-1（Bol004901）、BolMTP1-2（Bol014388） 和BolMTP1-3（Bol021804）。在甘藍型油菜A亞基因組中獲得3條序列，分別位于A03、A04和A05染色體上，命名為BnMTP1A03（BnaA03g21530D）、BnMTP1A04（BnaA04g26760D）和BnMTP1A05（BnaA05g01080D）；在C亞基因組中獲得1條序列，位于C04染色體上，命名為BnMTP1C04（BnaC04g00620D）。這些基因編碼序列（coding sequence, CDS）長度為 990～1 437 bp，除BnMTP1A04含有4個外顯子外，蕓薹屬AC基因組中的其他MTP1基因均只含有1個外顯子。

表1 蕓薹屬AC基因組MTP1基因的相關信息

2.2 MTP1蛋白的理化性質及亞細胞定位

利用軟件Plant-mPLoc對蕓薹屬AC基因組中鑒定的MTP1蛋白進行亞細胞定位分析，結果發現該蛋白均定位于液泡，結合擬南芥AtMTP1蛋白定位于液泡膜，故推測這些MTP1蛋白也屬于液泡跨膜轉運蛋白，助其行使金屬鋅離子的跨膜轉運。

使用ProtParam在線分析工具對MTP1蛋白進行理化性質分析，結果（表2）表明，蕓薹屬AC基因組中的MTP1蛋白均包含20種常見氨基酸，均不含有硒代半胱氨酸和吡咯賴氨酸。蛋白序列長度最短的為329 aa（BnMTP1C04和BolMTP1-1），最長的為478 aa（BnMTP1A04）；分子量最小的為36.59 749 ku（BolMTP1-1），最大為53.07 049 ku（BnMTP1A04）；等電點（pI）最低為5.69（BnMTP1A05和BolMTP1-2），最高為7.03（BnMTP1A04）；穩定性系數最小為32.93（BolMTP1-1），最大為42.23（BnMTP1A04），除BnMTP1A04外均為穩定蛋白（＜40）；脂肪族氨基酸系數最小為106.46（BnMTP1A04），最大為121.73（BnMTP1C04和BolMTP1-1）；帶負電荷氨基酸殘基數（Asp/Glu）和帶正電荷氨基酸殘基數（Arg/Lys）最小值分別為37、22（BnMTP1C04和BolMTP1-1），最大值為47、45（BnMTP1C04和BolMTP1-1）。

親疏水性分析發現肽鏈總體均表現為疏水性（正值），疏水性系數最小為0.091（BnMTP1A04），最大為0.359（BolMTP1-1），可見這些MTP1蛋白均表現為疏水性，不是水溶性蛋白，這與其屬于膜蛋白的特性相吻合。

表2 蕓薹屬AC基因組MTP1蛋白的理化性質

2.3 蕓薹屬AC基因組中MTP1基因進化分析及蛋白結構預測

蛋白質的二級結構是連接一級和高級結構的重要紐帶和橋梁，它為高級結構分析奠定了基礎［21］。使用在線分析軟件SOPMA對MTP1蛋白的二級結構進行分析，發現MTP1蛋白主要由α-螺旋、無規則卷曲、延伸鏈和β-轉角等4種結構組成（表3），α-螺旋為主要結構元件，占比接近50%，其次是無規則卷曲和延伸鏈，β-轉角最少。CDF家族中MTP轉運蛋白擁有多個跨膜結構域，其二級結構主要由α-螺旋組成，預測結果符合MTP1轉運蛋白的基本結構特征。

表3 MTP1蛋白二級結構預測

2.4 MTP1蛋白跨膜結構域和磷酸化位點分析

利用HMHMM Server軟件對MTP1蛋白進行跨膜結構域分析，結果（表4）表明，這些蛋白的典型結構特征具有6個跨膜結構域（TM1～TM6）。擬南芥的AtMTP1蛋白第一跨膜區在前60 aa區間內，蕓薹屬AC基因組的MTP1蛋白中，BnMTP1C04、BolMTP1-1和BolMTP1-2的第一跨膜區均在前60 aa區間內，除了BnMTP1A04外，所有MTP1蛋白的第一跨膜區均是從前60 aa區間開始，BnMTP1A04從155號氨基酸殘基開始。MTP1蛋白的6個跨膜結構域中，前4個跨膜域連續串聯分布，后2個跨膜域連續串聯分布，在第四和第五跨膜區之間有一個長環。

蛋白質磷酸化是生物體內普遍存在的一種重要活性調節機制。使用NetPhos 3.1軟件對蕓薹屬AC基因組中MTP1蛋白的磷酸化位點進行分析，結果（表5）發現白菜、甘藍和甘藍型油菜的MTP1均具有多種不同的磷酸化位點，其中，絲氨酸磷酸化位點（Ser）最多為25個（BnMTP1A04），最少為11個（BnMTP1C04、BolMTP1-1）；蘇氨酸磷酸化位點（Thr）最多為14個（BnMTP1A04、BnMTP1A05），最少為7個（BolMTP1-2）；酪氨酸磷酸化位點（Tyr）只在甘藍BolMTP1-2中具有1個，其他MTP1蛋白均不具有酪氨酸磷酸化位點。說明MTP1蛋白的磷酸化主要以絲氨酸和蘇氨酸磷酸化為主。

表4 MTP1蛋白跨膜結構域預測

表5 MTP1蛋白的磷酸化位點分析

2.5 MTP1蛋白系統進化分析

使用MEGA5.2軟件的NJ法構建蕓薹屬AC基因組MTP1的系統發育樹，結果（圖1）表明，甘藍型油菜BnMTP1A03與白菜BrMTP1A03、BnMTP1C04與 甘 藍BolMTP1-1、BnMTP1A04與BolMTP1-3分別聚類在同一個分支上，說明其遺傳距離最近；BnMTP1C04、BolMTP1-1又與BnMTP1A05聚類在一個分支上，說明其遺傳距離較近；而AtMTP1和BolMTP1-2分別在單獨一個分支上。根據氨基酸構建的系統進化樹，也反映其同源進化的親緣關系，甘藍型油菜A亞基因組的BnMTP1A03與白菜A基因組的BrMTP1A03親緣關系最近；甘藍型油菜C亞基因組的BnMTP1C04與甘藍C基因組的BolMTP1-1親緣關系最近，同時與甘藍型油菜A亞基因組的BnMTP1A05親緣關系較近；而甘藍型油菜A亞基因組的BnMTP1A04與甘藍C基因組的BolMTP1-3親緣關系最近，說明甘藍型油菜在繼承白菜和甘藍基因組的同時，不同亞基因組之間發生融合重組事件。

圖1 蕓薹屬AC基因組MTP1蛋白的系統進化樹

2.6 甘藍型油菜BnMTP1基因不同組織部位表達模式分析

為了進一步從基因表達水平上研究MTP1基因的表達模式，利用已發表的甘藍型油菜栽培種中雙11的轉錄組數據，分別提取根、莖桿、幼葉、成熟葉、花蕾和花后10 d、21 d、30 d種子中BnMTP1基因表達量的FPKM值進行比較分析。如圖2所示，在甘藍型油菜中MTP1基因在不同組織部位中均有表達，BnMTP1A03和BnMTP1A05在花蕾中的表達量最高，而BnMTP1A04和BnMTP1C04在花后10 d種子中的表達量最高；BnMTP1A04和BnMTP1A05在根中的表達量最低，BnMTP1A03和BnMTP1C04在花后30 d種子中的表達量最低。甘藍型油菜中4個BnMTP1同源基因的表達水平也存在明顯差異，BnMTP1A04表達水平相對最高，明顯高于其他3個基因，BnMTP1A03的表達水平相對最低。

圖2 油菜BnMTP1基因表達模式分析

3 結論與討論

近年來有關植物重金屬跨膜轉運載體的研究取得重要進展［22］，如HMA、ABCA、CAX等轉運金屬離子跨膜運載蛋白的基因已有報道，根據其位于不同組織細胞和不同細胞器，分為金屬離子輸入蛋白（Metal uptake protein）和金屬離子輸出蛋白（Metal efflux protein），分別介導金屬離子進入和泵出胞質。而且這些基因的過量表達對金屬在細胞中的運輸、分布和富集及提高植物的抗性方面發揮了重要作用［23］。目前研究較為深入的主要有CDF家族［24］、ZIP（Zinc-Iron Regulated Transproter Proteins）家 族、Nramp（Natural Resistance-Associated Macrophage Proteins）家族、重金屬ATP酶（HMAs）、ABC（ATP-Binding Cassette）轉運蛋白以及金屬陽離子/H+反向運輸器等［25-26］。本研究旨在從生物信息學層面解析蕓薹屬AC基因組中CDF家族成員MTP1基因和蛋白的特性，為后續研究其分子功能奠定基礎。

MTP1蛋白在植物中普遍存在，且仍不斷有新的CDF家族蛋白被鑒定［27］，對其研究也不斷深入，但MTP1蛋白的結構和功能機制還有較多未知，有待進一步研究。結構上MTP1蛋白的三維結構分析仍然處于使用模型分析軟件進行推測階段，楊樹中負責轉運鋅離子的PtMTP蛋白在體外形成一個寡聚同系物［28］，其可被二硫蘇糖醇破壞，說明二硫鍵可能在其形成過程中起到一定作用，MTP蛋白很可能是以同型二聚體的形式存在并發揮功能。本研究通過比對蕓薹屬白菜、甘藍和甘藍型油菜等物種的基因組，在AC基因組中共鑒定到8個MTP1基因，并對其蛋白質一級、二級結構進行分析，發現這些MTP1蛋白含有20種常見氨基酸，二級結構以α-螺旋、無規則卷曲和延伸鏈為主，跨膜結構域預測發現均含有6個跨膜結構域，與已有文獻報道一致，屬于膜蛋白。功能上MTP1蛋白不僅有轉運金屬離子的作用，在抵抗重金屬脅迫過程也扮演重要角色，用于解除過度積累的金屬對生物的毒性，還可能用于促進離子傳遞的信號轉導［29］。對蕓薹屬AC基因組MTP1蛋白進行理化性質分析，發現均為穩定性蛋白，表現為疏水性，這與其屬于膜蛋白的特性相吻合，利于執行轉運金屬離子的功能。

擬南芥AtMTP1 基因［30］和苜蓿MtMTP1［31］基因主要在幼嫩的葉片中表達，水稻OsMTP1基因［33］主要在成熟老葉和莖中表達，煙草NtMTP1基因［12］則主要在花和葉片中表達，根、莖和種子中的表達量較低。本研究中甘藍型油菜BnMTP1基因在花蕾和花后10 d種子中的表達量較高，根和莖的表達量最低，其次是葉片。甘藍型油菜BnMTP1基因在不同的組織部位中均有表達，地上部分的表達高于根部的表達，說明地上部分的金屬離子轉運更活躍。這些結果為進一步研究蕓薹屬植物MTP1轉運蛋白的功能和轉運機制奠定基礎，目前甘藍型油菜BnMTP1轉運蛋白的研究較少，若通過基因工程等分子技術實現甘藍型油菜對重金屬鎘的富集，將推進新用途油菜的開發利用，為重金屬污染的生態修復提供幫助。