牛欄山二鍋頭大茬酒醅發酵過程中細菌群落結構分析

胡佳音,周 森,王 瑛,趙衛鵬,朱婷婷,魏金旺*

(北京順鑫農業股份有限公司牛欄山酒廠,北京 101301)

牛欄山二鍋頭屬于清香型白酒,其釀造過程是開放式的多菌種固態發酵,以高梁等谷物為原料,大曲為糖化發酵劑,采用清蒸清茬、固態地缸發酵、清蒸流酒[1]的釀造工藝,開放式的釀造方式使其網羅自然界的多種微生物,形成了專屬牛欄山二鍋頭的獨特菌群。

在白酒釀造中細菌是不可或缺的一類微生物,其往往具有數量較多、種類豐富等特點,常被認為是“生香動力軍”[2]。在牛欄山二鍋頭釀造過程中,細菌主要分為乳酸菌、芽孢桿菌和放線菌三大類群[3]。目前,對白酒微生物的研究方法主要分為傳統微生物分離和微生物非培養方法,傳統微生物分離是白酒微生物研究中較為常用的技術手段,它主要適用于發酵中可培養類微生物,可以有效地確定微生物數量的變化規律并獲得活體菌株,如王慶宇等[4]采用多種培養基對老白干制曲過程中多種培養基進行微生物分離,確定不同培養基對大曲中一般性細菌、乳桿菌、乳球菌、霉菌、酵母菌具有較好的分離效果。近幾年來,隨著分子生物學技術的快速發展和在復雜環境微生物群落結構分析中的應用,基于現代分子生物技術的微生物非培養方法研究逐漸成為熱點[5],如高亦豹等[6]利用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳(polymerasechain reaction-denaturinggradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)方法分析了我國白酒高溫和中溫大曲細菌群落結構,得出不同工藝大曲細菌群落結構存在明顯差異;唐婧等[7]利用高通量測序分析了茅臺酒曲微生物多樣性,確定了茅臺大曲中的細菌組成;鄧杰等[8]利用高通量測序技術分析了濃香型白酒窖池窖泥細菌群落結構,建立了一套完整的窖泥微生物群落結構研究方法并獲得不同窖齡窖泥微生物群落結構。

本研究利用傳統微生物分離和高通量測序技術相結合的方法,分析了牛欄山二鍋頭大茬酒醅發酵過程中細菌結構的變化。確定了釀造過程中細菌的變化規律及優勢微生物,為清香型白酒優良細菌微生物的篩選及其功能性研究提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

牛欄山二鍋頭大茬酒醅:牛欄山酒廠冬季第一次入缸發酵的高粱。

1.1.2 試劑

三氯甲烷、異戊醇、異丙醇(均為分析純):上海生工生物工程有限公司;Fast DNA SPIN Kit for Soil(MPbio土壤基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)提取試劑盒):北京比特博生物技術有限公司。

1.1.3 培養基

乳酸菌分離培養基:采用乳酸細菌(MRS)培養基。牛肉膏10 g,酪蛋白胨30 g,酵母提取物5 g,葡萄糖20 g,乙酸鈉5g,檸檬酸氫二胺2g,吐溫801 mL,MgSO4·7H2O 0.58 g,K2HPO42 g,MnSO4·H2O 0.25 g,萘啶酮酸50 mg,瓊脂15 g,蒸餾水1 L。

芽孢桿菌分離培養基:采用肉汁(nutrient broth,NB)培養基。蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,NaCl 5 g,瓊脂15 g,蒸餾水1 L。

放線菌分離培養基:采用鏈霉菌培養基2號(ISP2)培養基。酵母提取物4 g,麥芽提取物5 g,D-葡萄糖4 g,萘啶酮酸50 mg,瓊脂18 g,蒸餾水1 L,pH 7.3。

細菌基礎培養基:采用LB培養基。胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,氯化鈉10 g,蒸餾水1 L。

以上培養基均在121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

BSC-1100ⅡA2型生物安全柜:北京東聯哈爾儀器制造有限公司;C1000快速梯度基因擴增儀、基礎型水平電泳儀、全自動凝膠成像儀:美國BIORAD公司;1-14k高速冷凍離心機:德國Eppendorf公司;SPX-320型生化培養箱:寧波江南儀器廠;MPFastPrep-24樣品快速制備系統:美國MP公司;L95系列智能溫度記錄儀:上海發泰精密儀器表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大茬酒醅發酵溫度曲線的測定

將溫度記錄儀探頭埋入地缸中心點,距地缸表面60 cm處,記錄大茬酒醅發酵過程中溫度的變化過程。

1.3.2 大茬酒醅細菌分離

取樣:根據大茬酒醅發酵溫度曲線的特點,從整個發酵周期28d中確定6個時間點采集樣品,選取同批次發酵的三缸作為取樣缸(平行樣品),標記為A缸、B缸、C缸,入池0 d的樣品乃取一份,其余5份樣品取樣位置為地缸中心點與缸壁之間,距地缸表面60 cm深處,樣品編號為D5A、D5B、D5C(D5代表取樣時間),其余取樣點以此類推。

分離:分別稱取不同釀造時間的酒醅樣品10g于90 mL無菌水中稀釋,擬定為10-1梯度。依次稀釋為10-2、10-3、10-4、10-5梯度,根據發酵時間吸取不同梯度稀釋液0.1 mL涂布于相應培養基平板。分離方法及培養條件如表1所不。

表1 大茬酒醅中微生物的分離培養基及方法Table1 Isolation mediums and methods of microorganisms in Dacha fermented grains

計數:培養時間根據菌落的生長情況而定,一般為24～48 h,一般選擇菌落數在20～300 CFU/mL之間的平板進行計數。在這個范圍之外則不能正確地指不樣品中微生物的真實數量。具體計數原則如下:

為了避免虛假精確度的產生,當進行活菌計數時,保留一位有效數字,按照四舍五入原則對其進行取舍。每毫升菌落形成的單位(colony formingunit,CFU)=同一稀釋度3次重復的平均菌落數×稀釋倍數×10,根據稀釋倍數統計不同培養基中微生物的種群數量,獲得發酵過程中細菌微生物數量變化規律[9]。

1.3.3 大茬酒醅高通量測序

(1)大茬酒醅總DNA的提取

分別稱取不同發酵時期的大茬酒醅樣品1 g,用快速樣品制備系統(Fastprep)處理后,采用MPbio土壤基因組DNA提取試劑盒(Fast DNA SPIN Kit for Soil)提取不同發酵時期大茬酒醅的基因組。

(2)大茬酒醅的高通量測序

所提DNA經瓊脂糖凝膠電泳檢測后,送往北京奧維森公司,利用IlluminaMiSeq對細菌的16SrDNA V3/V4區序列進行高通量測序,測序引物為正向引物:5'-GTACTCCTACGGGAGGCAGCA-3';反向引物:5'-GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。原始測序序列通過軟件Fastqc進行質量檢測去除低質量Reads(過濾標準:Q20≥90%)。通過(connectingoverlappedpair-end,COPE)軟件進行序列拼接、過濾。利用Mothur軟件以平均鄰近聚類算法(average neighbor clusteringalgorithm)在0.03(或97%的相似度)水平下對Clean Tags進行操作分類單元(operationaL taxonomic units,OTU)的聚類,統計每個樣品每種OTU中的豐度信息。選取分析數據中每個OTU中一個有代表性的序列進行Blast比對,獲得每一個OTU所代表的種名[10-12]。

2 結果與分析

2.1 大茬酒醅發酵溫度曲線

大茬酒醅的發酵溫度曲線如圖1所不。

圖1 大茬酒醅發酵溫度曲線及取樣點Fig.1 Fermentation temperature curve of Dacha fermented grains and sampling points

由圖1可知,酒醅升溫曲線較為理想,呈現前緩升、中挺、后緩落的趨勢,即0～9 d屬于溫度前緩升階段,溫度的緩慢上升利于控制微生物生長速度,防止酒醅生酸過猛,維持正常發酵的進行;9～13 d為中挺階段,溫度較為穩定,是前緩升階段和后緩落階段的交接期;13～28 d為后緩落期,溫度緩慢降低,該階段酒精發酵基本結束,主要以生香為主。因此本研究所選取的6個取樣點分別為0 d、5 d、9 d、13d、19d、28d,涵蓋了發酵的3個階段,具有較好的代表性[13]。

2.2 大茬酒醅細菌數量變化規律

分別對發酵過程中乳酸菌、芽孢桿菌、常規細菌和放線菌4類細菌進行數量跟蹤,其中放線菌數量較少,僅在入池0 d和13d稀釋梯度為10-1的樣品中分離檢測到,不具備規律性,所以本研究乃討論發酵過程中乳酸菌、芽孢桿菌和常規細菌變化規律,結果見圖2。

由圖2可知,在入池階段,酒醅中含有大量的乳酸菌(10.6 lg(CFU/g)),遠高于芽孢桿菌(5.8 lg(CFU/g))和常規細菌(5.7 lg(CFU/g)),是入池階段的主要細菌。隨著發酵的進行,在緩升階段(0～9 d),乳酸菌快速增長,菌落總數由10.6 lg(CFU/g)增長至14.5 lg(CFU/g);在中挺階段(9～13 d)及后緩落期(13～28 d),乳酸菌數量仍緩慢增長,在發酵19d時,乳酸菌數量達到最高值,為15.53lg(CFU/g);發酵28d時,乳酸菌數量出現了少量降低。入池發酵后,芽孢桿菌數量緩慢降低,發酵5 d,芽孢桿菌數由5.80 lg(CFU/g)下降至5.02lg(CFU/g);發酵5d后,芽孢桿菌數量緩慢增長,菌落總數在出池階段達到最高值,為5.92lg(CFU/g)。常規細菌數量由入池階段的5.71 lg(CFU/g)緩慢增長至出池階段的最高值5.99 lg(CFU/g)。與乳酸菌相比,芽孢桿菌和常規細菌數量增長僅為0.11lg(CFU/g)和0.28lg(CFU/g),說明二鍋頭發酵過程中芽孢桿菌和常規細菌數量基本穩定,變化幅度較小。整體分析得出,牛欄山二鍋頭酒醅發酵過程中芽孢桿菌和常規細菌數量基本穩定,乳酸菌是發酵過程主體細菌類微生物。

圖2 大茬酒醅發酵期間細菌數量的變化Fig.2 Changes of the bacterial population in Dacha fermented grains during fermentation process

2.3 高通量測序分析

通過高通量測序,共獲得559種細菌OTU,主要包括乳桿菌科(Lactobacillaceae)、高溫放線菌科(Thermoactinomycetaceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)和醋桿菌科(Acetobacteraceae)。篩選出占總reads比例＞1%的微生物進行分析,結果見表2。

表2 菌種的數量比例Table2 Proportion of bacteria

由表2可知,酒醅發酵過程中,占總reads比例＞1%的細菌共有14種,主要由3種類群組成,包括1種高溫放線菌(Thermoactinomyces)、1種醋酸菌(Acetobacter pasteurianus)和12種乳酸菌,14種細菌reads之和可占發酵過程總reads數的91.82%,因此可以確認其能夠較為全面的反應大茬酒醅發酵過程中細菌類群的變化規律。

根據不同的發酵時間對14種細菌進行分析,獲得發酵過程細菌多樣性變化情況,結果如圖3所不。

圖3 基于高通量測序結果大茬酒醅中細菌物種多樣性和演替Fig.3 Bacterial diversity and succession in Dacha fermented grains based on high-throughput sequencing results

由圖3可知,在入池階段(0 d),大茬酒醅中主要細菌為融合維斯氏菌(Weissella confusa)、巴氏醋酸菌(Aceto bacter pasteurianus)、德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)和others(14種以外的細菌),說明在入池階段,大茬酒醅中含有隨大曲及環境帶入的多種細菌類微生物;緩升階段(0～9 d)是二鍋頭釀造的生酸階段,在該階段乳酸菌快速增長,戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、黑龍江乳桿菌(Lactobacillus heilongjiangensis)、類布氏乳桿菌(Lactobacillusparabuchneri)和W.confusa逐漸成為了酒醅內主體細菌,乳酸菌大量增長所生成的有機酸類有助于提高酒醅的酸度,維持發酵的正常進行,也為乳酸乙酯的合成提供了前體物質;中挺階段(9～13 d)是酒精發酵的主發酵階段,占整個發酵周期酒精生成量的90%以上,較高的酒精含量抑制了乳酸菌的生長,使乳酸菌數量和種類維持穩定,主要以P.pentosaceus、L.heilongjiangensis、L.parabuchneri和L.brevis為主;發酵后緩落期(13～28 d)是各種香味成分相互融合、相互轉化的過程,可使酒質更加醇厚綿柔,回味綿長,在該階段酒醅中乳酸菌數量稍有增長且種類出現更替,耐酸乳桿菌(Lactobacillusacetotolerans)成為了發酵后緩落期的主體細菌類微生物,在出池樣品中其可占細菌比例的71.37%～74.8%。目前,對于二鍋頭酒中耐酸乳桿菌的研究較少,其在釀造后緩落期的具體作用還尚不明確,還需要進一步研究[14]。

3 結論

本研究利用傳統分離技術和高通量測序技術相結合的方法對牛欄山二鍋頭大茬酒醅發酵期間的細菌多樣性進行研究,從微生物數量演替和種屬多樣性變化兩方面,系統解析了牛欄山二鍋頭酒醅發酵過程中細菌群落的演替規律。研究結果表明,乳酸菌在發酵過程中,數量大量增長,在發酵的前緩、中挺、后緩落3個階段,不同種屬乳酸菌分別成為發酵過程中的優勢菌,而芽孢桿菌和其余細菌數量基本維持穩定,且在高通量種屬比例中占有量較低;同時,高通量數據中發現高溫放線菌(Thermoactinomyces)在發酵前緩生階段占有一定比例,且目前在清香型白酒中未見報道,僅在芝麻香高溫大曲中發現[15],說明了在牛欄山二鍋頭酒醅釀造過程中存在一定量的高溫類放線菌類群,而其在發酵過程中的具體作用,還需進一步分析驗證。