響應面法優化發酵藍莓果醋發酵工藝條件

陳 曦,李國林,陳夢玉,黃道梅,孟繁博,鄭秀艷,林 茂*

(1.貴州省農業科學院 現代農業發展研究所,貴州 貴陽 550006;2.貴州金農輻照有限責任公司,貴州 貴陽 550006)

藍莓(blueberry)為杜鵑花科越橘屬植物。藍莓果實甜酸適度、口感佳,含有大量對人體健康有益的成分,其中富含芍藥素、矮牽牛素等多種花青素成分,具有良好的抗氧化能力。藍莓中所含有的單寧類物質可以有效抑制消化系統的不良癥狀[1-2]。1989年我國開始從美國、加拿大等地引種70余個品種藍莓,2008年以后貴州種植藍莓面積快速增長,據2015年統計數據,僅貴州黔東南苗族侗族自治州累計種植藍莓達12.8萬km2,成為中國最大人工種植藍莓地區,占全國種植面積的1/3[3]。藍莓具有不易保藏、產業化和利用率低的特點[4-5],因此,貴州藍莓深加工迫在眉睫。藍莓發酵制品的開發一直存在生產工藝不夠完善,發酵質量不夠穩定,發酵效率低的問題[6-9]。鑒于此,本研究利用響應面法對藍莓果醋的醋酸發酵工藝條件進行優化,從而確定藍莓果醋的最佳發酵條件。果醋發酵工藝條件經優化后不但具有果醋的風味和口感,還保留了藍莓本身的花青素、維生素、氨基酸等豐富的營養成分。使得消費者更易接受的同時擴大消費領域,也為藍莓果醋的開發與工業化生產研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

藍莓酒(酒精8.2%vol,pH 4.26):貴州省農產品加工研究所自制產品;滬釀1.01醋酸菌:上海釀造一廠。

1.1.2 化學試劑

葡萄糖、酵母膏、瓊脂(均為生化試劑):生工生物工程(上海)股份有限公司;碳酸鈣、氫氧化鈉(均為分析純):國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

醋酸菌試管斜面培養基[10]:酵母膏1%,葡萄糖1%,瓊脂粉2%,碳酸鈣1.5%,在121℃、0.1MPa條件下滅菌20min。

醋酸菌液體種子培養基[11]:酵母膏1%,葡萄糖1%,碳酸鈣1.5%,在121℃、0.1 MPa條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

HT-24X2H恒溫振蕩培養器:上海五久自動化設備有限公司;SW-CJ-1C無菌工作臺:無錫一凈凈化設備有限公司;LH-J80酒精度儀:上海樊克生物科技有限公司;雷磁PHS-25型酸度計:上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藍莓醋加工工藝流程及操作要點

操作要點:按比例加入無菌水調整成不同酒精度、不同pH值的藍莓酒后,巴氏滅菌溫度為75℃,維持15 min,進行滅菌處理,將體積分數20%的藍莓酒裝入250 mL錐形瓶中,按體積分數15%的接種量接入醋酸菌活化液,用紗布封口,在轉速180 r/min、溫度為30℃條件下進行醋酸發酵,時間5 d,利用60Co-γ輻照劑量為1 000 Gy,且以3～4 Gy/min的劑量率進行輻射,輻射后陳釀15 d,用膜過濾設備進行澄清處理后,在121℃條件下進行超高溫瞬時滅菌30 s。

1.3.2 藍莓果醋的醋酸發酵條件優化

(1)單因素試驗

通過前期預實驗結果,擬采用初始pH值(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)、初始酒精度(5%vol、6%vol、7%vol、8%vol、9%vol)、發酵時間(1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d)、轉速(160r/min、180r/min、200r/min、220 r/min)、發酵溫度(26 ℃、28℃、30℃、32℃、34℃)這5個影響因素進行單因素試驗,以藍莓果醋醋酸產量為評價指標。篩選出對藍莓果醋影響較大的因素進行響應面優化試驗,所做試驗均重復3次。

(2)響應面試驗設計

在單因素試驗分析結果的基礎上,以醋酸產量(Y)為響應值,選取4個影響較大的因素發酵時間(A)、初始pH值(B)、轉速(C)、初始酒精度(D)進行藍莓果醋醋酸發酵條件響應面優化試驗,采用Design-Expert軟件進行4因素3水平的響應面設計,將得到的試驗數據進行二次多項回歸擬合,所做試驗均重復3次。響應面設計試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.3 分析檢測

pH測定:用pH計測定;酒精度測定:酒精密度瓶法,按國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》的方法測定[12]。

醋酸產量的測定采用酸堿定法:取1 mL的發酵液于250 mL錐形瓶中,加入蒸餾水20 mL,用0.1 mol/L的NaOH標準溶液進行滴定至pH值8.2,并計算醋酸產量[13]。醋酸含量計算公式如下:

式中:X為樣品中醋酸產量,g/100 mL;c為NaOH標準溶液濃度,mol/L;V0為空白實驗消耗NaOH標準溶液體積,mL;V1為樣品滴定時消耗NaOH標準溶液的體積,mL;0.06為1 mol NaOH相當于醋酸的質量,mg。

1.3.4 數據處理方法

單因素試驗數據利用Origin8.0軟件處理軟件對進行處理和分析;響應面優化設計分析利用Design Expert17.0設計軟件;顯著性差異分析采用SPSS17.0統計軟件進行。

2 結果與分析

2.1 發酵藍莓果醋工藝優化單因素試驗

2.1.1 初始pH值對藍莓果醋發酵的影響

醋酸菌的繁殖速度和產酸能力受初始pH值的影響,初始pH值過高或過低都會抑制醋酸菌的生長,致使醋酸產量低[14]。由圖1可知,當初始pH值在3.0及5.5時,醋酸菌生長緩慢,致使產酸效率低,總產量也低于其他初始pH值組。當初始pH值在3.5～4.5之間時,醋酸菌在此pH值范圍內生長迅速,產酸能力強,積累的醋酸量較多。因此,響應面優化試驗選取pH值為3.5～4.5。

圖1 不同初始pH值對藍莓果醋發酵的影響Fig.1 Effect of different initial pH values on blueberry vinegar fermentation

2.1.2 轉速對藍莓醋發酵的影響

醋酸菌作為好養微生物,在氧氣充足時,其生理代謝活動旺盛,產醋酸量快。由圖2可知,發酵0～5 d,轉速越高,產酸變化幅度越大,說明轉速越高,醋酸菌產酸能力越強;發酵到5～7 d,不同轉速下,累計產酸量相差較小。因此,選擇轉速為180～220 r/min。

圖2 轉速對藍莓果醋發酵的影響Fig.2 Effect of rotational speed on blueberry vinegar fermentation

2.1.3 初始酒精度對藍莓果醋發酵的影響

據文獻報道,初始酒精度越高,產酸量越多,但酒精度過高會抑制醋酸菌的生長,難以生產醋酸[15]。由圖3可知,在酒精度達到9%vol時,醋酸菌生長受到抑制,產醋酸量低;在酒精度為5%vol時,由于酒精量不足以提供醋酸菌生產代謝,故產醋酸量也較酒精度在6%vol～8%vol低;酒精度為6%vol～8%vol時,不僅滿足醋酸菌生長所需的營養物質,還保證了醋酸菌的生長代謝不受抑制,因此,選擇酒精度為6%vol～8%vol。

圖3 不同初始酒精度對藍莓果醋發酵的影響Fig.3 Effect of different initial alcohol contents on blueberry vinegar fermentation

2.1.4 發酵溫度對藍莓果醋發酵的影響

圖4 發酵溫度對藍莓果醋發酵的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on blueberry vinegar fermentation

微生物乃有在適宜溫度下,生長速度才最快,代謝時間最短[16]。醋酸菌在溫度過低時發酵效率低,產酸量少,溫度過高的話,會造成醋酸菌老化加快,醋酸產量低[17]。由圖4可知,隨著發酵時間的延長,在不同溫度條件下,醋酸菌產酸量逐漸增加,在30℃條件下發酵,最終醋酸產量最高,為5.48 g/100 mL,經數據分析,差異性顯著(P＜0.05)。因此,選擇30℃作為最適發酵溫度。

2.2 Box-Behnken Design響應面設計

采用Design Expert 17.0軟件進行4因素3水平的響應面設計。固定醋酸發酵溫度為30℃,根據上述單因素試驗結果,選擇發酵時間為4～6 d,以發酵時間(A)、初始pH值(B)、轉速(C)、初始酒精度(D)4個因素為自變量,醋酸產量(Y)為響應值,設計4因素3水平Box-Behnken試驗方案,響應面設計試驗結果見表2,方差分析見表3。利用Design Expert軟件對表2進行回歸分析,得到醋酸產量對自變量發酵時間(A)、初始pH值(B)、轉速(C)及初始酒精度(D)的二次多項回歸方程為:

表2 響應面試驗設計及結果Table2 Design and results of response surface experiments

表3 回歸模型方差分析Table3 Variance analysis of regression model

由表3可知,該模型P＜0.000 1,回歸模型方程極顯著;失擬項P=0.054 2＞0.05,不顯著,表明該方程合理可行;決定系數R2=0.956 5,模型的校正決定系數R2Adj=0.912 9,說明該模型能解釋91.29%響應值的變化。

模型方程的一次項A、D的P值均＜0.05,說明發酵時間和初始酒精度對結果有顯著的影響,且一次項各因素對醋酸產量影響的大小順序為:初始酒精度(D)＞發酵時間(A)＞轉速(C)＞初始pH值(B)。二次項A2、B2、C2、D2的P值均＜0.01,具有極高的顯著性,說明醋酸產量的變化相對復雜,發酵時間、初始pH值、轉速、初始酒精度對醋酸產量的影響不是簡單的線性關系,響應面效應顯著。該回歸方程的擬合度和可信度均較好,可用于藍莓果醋醋酸產量的理論預測[18]。

經軟件Design Expert7.0優化,分析得到藍莓醋酸發酵的最佳工藝條件為:發酵時間5.13 d、初始pH值4.01、轉速202 r/min、初始酒精度6.8%vol,根據模型預測得到的理論最大醋酸產量為5.75 g/100 mL。

圖5 發酵時間、初始pH值、轉速和初始酒精度的交互作用對藍莓果醋發酵影響的響應面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation time,initial pH value,rotational speed and initial alcohol content on blueberry vinegar fermentation

2.3 驗證試驗

為了驗證模型預測的可靠性,同時考慮到實際操作的便利,將最佳工藝條件修正為:發酵時間5 d、初始pH值4.0、轉速202 r/min、初始酒精度7.0%vol,在最佳處理條件下,測得醋酸產量為5.63g/100mL。實測值與預測值誤差為3.82%,證明響應面法優化的藍莓果醋發酵工藝是可行的,具有實際應用價值。

3 結論

根據單因素試驗和Box-Benhnken響應面優化試驗,優化的醋酸發酵工藝條件為發酵時間5 d、初始初始pH值4.0、轉速202 r/min、初始酒精度7.0%vol、發酵溫度30 ℃。在本試驗范圍內建立的模型準確有效,可用來預測設定條件范圍內及其周圍的藍莓果醋發酵工藝參數。在此優化條件下發酵所得藍莓果醋的醋酸產量為5.63 g/100 mL,且具有醋香濃郁、藍莓典型香氣和色澤的特點。優化發酵工藝后的藍莓果醋為后續研究輻照陳香奠定基礎。