高產糖化酶根霉菌株的篩選、鑒定及其在孝感米酒中的應用

南小華,李 牧,陳福生*

(華中農業大學 食品科技學院,湖北 武漢 430070)

米酒是以大米(秈米、粳米、糯米等)為原料經酒曲中的微生物釀造而成的,是我國傳統的發酵酒精飲料,世界古代三大酒精飲料之一[1]。因其酒精含量較低,口味獨特,口感醇厚,香氣濃郁,酸甜適中且富含多種氨基酸、維生素以及葡萄糖、麥芽糖、低聚糖等,深受人們的喜愛[2]。糖化是米酒發酵的重要階段,主要由酒曲中微生物分泌的淀粉酶將大米淀粉轉化為單糖、麥芽糖、糊精等[3]。糖化力的高低直接影響米酒的出酒率,也會影響米酒的口感和風味[4]。根霉(Rhizopus spp.)作為糖化酶的產生菌種之一,目前國內外對根霉產糖化酶條件的優化較多[5-7],在米酒釀造方面也有研究[8-9],但對于孝感米酒的研究較少。

孝感米酒作為湖北地方特色小吃,以鳳窩酒曲發酵釀制而成,是一種酒精度低、營養價值高的固體發酵飲料[10]。酒曲作為“酒之骨”,是決定米酒品質的關鍵[11]。傳統鳳窩酒曲是在特定的生態環境內,以成曲作為母種在開放體系中培養制得[12]。菌種除優勢菌根霉外,還包括細菌、酵母菌等其他微生物。由于自然環境下制得的酒曲微生物種類豐富,群落結構復雜,且微生物類群容易隨環境溫度、濕度季節性變化而發生改變,使得酒曲質量不穩定,加上生產孝感米酒的多數企業仍是以手工作坊式的生產方式為主,生產工藝難以控制,導致米酒產品質量不穩定[13]。

為了提高孝感米酒酒曲的質量,保證米酒的品質,本研究以實驗室從孝感米酒酒曲中分離的14株根霉菌株為材料,篩選1株高產糖化酶的優良根霉菌株,進行形態學和分子生物學鑒定。在此基礎上,以其為菌種,按照孝感米酒的釀造工藝釀造孝感米酒,并對孝感米酒的理化指標、感官品質及揮發性成分進行分析,為米酒的釀造提供優良菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原材料

糯米和秈米:市售優質米。

1.1.2 菌株

根霉(Rhizopus spp.)菌株R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、070101、070102、070103、070104、070105、Q1、S2:實驗室從孝感米酒酒曲中分離所得[3]。

1.1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potatodextroseagar,PDA)培養基:200 g土豆去皮后切成小塊,加水煮沸至玻璃棒正好能將土豆戳破后,過濾,加入20 g葡萄糖,15 g瓊脂粉,蒸餾水定容至1 000 mL,pH自然。

馬鈴薯葡萄糖肉湯(potato dextrose broth,PDB)培養基:PDA培養基中不加瓊脂。

普氏液(Pfeffer)培養基:NH4NO310 g,KH2PO45 g,MgSO4·7H2O0.25g,FeCl30.01g,蔗糖50g,蒸餾水1000mL,調節pH至4.5。

糯米飯培養基:稱取100g糯米于飯盒中,加水浸泡12h后,瀝干。

米粉培養基:秈米磨碎,過60目篩,分裝于250 mL三角瓶,20 g/瓶。

除米飯培養基于105℃滅菌30 min外,其他培養基于121℃條件下滅菌20 min。

1.1.4 主要試劑

葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)、NaOH、可溶性淀粉、NaHCO3、KH2PO4、乙酸、乙酸鈉等(均為分析純)、環己酮(純度≥99%):國藥集團化學試劑有限公司;18SrDNA通用引物、膠回收試劑盒:上海生物工程公司合成;Easy Taq脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)polymerase(5 U/μL)、三磷酸脫氧核糖核苷(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTPs)、DL 2000 Plus DNA marker:北京全式金生物技術有限公司;γ-氨基丁酸標準品(純度≥99%)、2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene,DNFB)(純度≥99%):阿拉丁公司。

1.2 儀器與設備

T960聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction,PCR)儀:杭州博日科技有限公司;WD-9413B凝膠成像分析儀、DYY-8C電泳儀:北京六一生物科技有限公司;722N紫外可見分光光度計:上海儀電分析儀器有限公司;TQ8040氣相色譜質譜(gaschromatography-massspectrometry,GC-MS)聯用儀:日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 高產糖化酶根霉菌株的篩選

將30 mL無菌水加入無菌糯米飯培養基中,用無菌筷子將糯米飯打散,分別接種2 mL根霉R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、070101、070102、070103、070104、070105、Q1、S2的孢子懸液(1×106CFU/mL),混勻后,于30℃培養3 d,分別測定糖化酶活力、還原糖含量、總酸度,并對其進行感官評價,篩選獲得高產糖化酶的菌株。

1.3.2 根霉Q1的鑒定

(1)形態學鑒定[14-15]

菌株的活化:用接種環接種少量根霉Q1菌絲于PDA試管斜面,于28℃培養3 d。

菌落形態觀察:將活化好的根霉Q1點接于PDA培養皿上,于28℃培養箱中進行培養,培養2～3d,觀察其菌落形態。

顯微形態觀察:采用插片法[16]對根霉Q1顯微形態進行觀察。

根霉Q1在不同溫度條件下的生長情況:分別接種2%(V/V)根霉Q1孢子懸液(1×106CFU/mL)于普氏培養液和PDB培養基中,分別將其置于30℃、37℃、45℃條件下、170 r/min的搖床中進行培養,觀察其生長情況。

(2)分子生物學鑒定

采用十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethylammonium bromide,CTAB)法提取根霉Q1的基因組DNA,以其基因組DNA為模板,利用真菌18SrDNA通用引物進行PCR擴增[17]。擴增產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,并用膠回收試劑盒對其PCR擴增產物純化,純化后送至上海生工完成測序。將測序結果在美國國立生物技術信息中心(national center for biotechnologyinformation,NCBI)中進行Blast同源性比對分析,選取相似度為97%以上的不同根霉種序列,利用Mega7.0進行多序列比對,根據鄰近法(neighborjoining,NJ)構建系統進化樹。

1.3.3 孝感米酒的制作工藝及操作要點

孝感米酒制作的工藝流程[18]:

操作要點:

(1)洗米、浸米:挑選優質糯米,用自來水清洗干凈,室溫浸泡8～10 h。

(2)蒸飯:將糯米取出用紗布瀝干水后置于高壓蒸汽滅菌鍋中121℃蒸米20 min。

(3)淋飯:蒸煮好的糯米取出立刻用涼開水沖洗使糯米迅速降溫冷卻。

(4)制曲:向無菌米粉培養基中加入6 mL無菌水,接種0.4 mL(2%,V/W)根霉Q1孢子懸液(1×106CFU/mL),于28℃培養4 d,取出置于40℃烘箱中烘干,粉碎保存。

(5)拌曲:將沖涼的糯米飯轉入玻璃泡菜壇中,按1%(W/W)接種量拌入純種米根霉Q1酒曲,用無菌筷子混勻。

(6)發酵:將接好曲的糯米飯放入30℃培養箱中培養發酵36 h。

對米酒中還原糖、總糖、酒精度、總酸度、揮發性風味成分、γ-氨基丁酸(gama-amino butyric acid,GABA)含量進行測定,并進行感官評價。

1.3.4 分析檢測方法

糖化酶活力的測定:采用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)法測定,具體參照文獻[19]。糖化酶酶活定義:1 g固體酶(或1 mL液體酶)在40℃、pH 4.6條件下,1 h內水解可溶性淀粉產生葡萄糖的毫克數,即為一個酶活力單位(U)。

還原糖含量的測定:采用DNS比色法進行測定,具體參照文獻[20]。

總糖含量的測定:采用苯酚-濃硫酸比色法進行測定,具體參照文獻[21]。

總酸度的測定:采用NaOH滴定法,具體參照國標GB/T 12456—2008《黃酒》[22]。

酒精度的測定:采用蒸餾-重鉻酸鉀比色法進行測定,具體參照文獻[23]。

GABA含量的測定:采用2,4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相色譜法進行測定,具體參照文獻[24]。

揮發性風味成分的分析:以環己酮作為內標,采用頂空固相微萃取(headspace solid-phase micro-extraction,HSSPME)和氣相色譜-串聯質譜法(GC-MS/MS)對根霉Q1釀造的孝感米酒中揮發性風味成分進行定性定量分析,具體參照文獻[25-26]。

感官評定:從氣味、口感、色澤和組織形態方面對根霉菌株發酵的糯米飯進行感官評分,由10位具有一定專業水平的人員組成評定小組進行客觀評分,滿分100分,感官評價標準見表1。

表1 米酒的感官評分標準Table1 Sensory evaluation standards of rice wine

2 結果與分析

2.1 高產糖化酶根霉的篩選

14株根霉菌在米飯培養基中發酵3 d后,測定糯米飯中的糖化酶酶活、還原糖含量和總酸度(以乳酸計),并進行感官評分測定,結果如圖1所不。

圖1 不同根霉菌株在糯米飯中的糖化酶酶活(A)、還原糖含量(B)、總酸含量(C)以及感官評分(D)測定結果Fig.1 Determination results of glucoamylase activity(A),reducing sugar content(B),total acid content(C)and sensory evaluation of different Rhizopus strains in glutinous rice

由圖1A可知,根霉Q1的糖化酶活力最高,為202.55U/g,其他13株根霉均＜100.00 U/g。圖1B可知,根霉Q1的還原糖含量最高,為257.78 mg/g,其余均＜150 mg/g,與糖化酶活力基本對應。由圖1C可知,根霉Q1、S2、070104發酵糯米飯的總酸度相對較低,分別為5.17 mg/g、3.52 mg/g、1.60mg/g。由圖1D結合表1的感官評分標準可知,根霉Q1釀造的米酒甜酸適中,感官評分最高,為81分,而其他根霉菌株釀造的米酒感官評分均較低。綜上,選擇根霉Q1為高產糖化酶的菌株。

2.2 根霉Q1的鑒定

2.2.1 形態學鑒定

菌落形態觀察:采用點接法對PDA平板上的根霉Q1菌落形態進行觀察,其結果如圖2所不。

圖2 根霉Q1培養2 d(A,B)和3 d(C,D)的菌落形態Fig.2 Colony morphology of Rhizopus Q1 cultured for 2 d(A,B)and 3 d(C,D)

由圖2可知,根霉Q1菌絲前期為白色,菌絲體向四周蔓延,且菌絲較為疏松,生長較快,第2天幾乎長滿整個平板,菌絲呈灰白色且菌絲頂端開始出現白色孢子,第3天菌絲體呈灰色甚至黑色,孢子也由白色變為灰黑色。

顯微形態觀察:采用插片法對PDA平板上根霉Q1的顯微形態進行觀察,其結果如圖3所不。

圖3 根霉Q1的顯微形態Fig.3 Micro-morphology of Rhizopus Q1

由圖3可知,根霉Q1菌絲無橫隔,假根較為發達,孢子囊呈球形或橢圓形,孢囊梗直立叢生,孢囊孢子形狀較為規則、長5～8μm、有線紋。

根霉Q1在Pfeffer液和PDB培養基中于不同溫度條件下的生長情況見表2。

表2 根霉Q1在Pfeffer液和PDB培養基在不同溫度條件下的生長情況Table2 Growth situation of Rhizopus Q1 in Pfeffer liquid and PDB medium at different temperature conditions

由表2可知,根霉Q1在Pfeffer液和PDB中30℃和37℃溫度下均可正常生長,45℃溫度條件下難以生長。

根據以上結果并參照真菌鑒定手冊[14]和真菌分類學[15]將根霉Q1初步鑒定為米根霉(Rhizopusoryzae)。

2.2.2 分子生物學鑒定

利用真菌18SrDNA通用引物對根霉Q1的18SrDNA序列進行PCR擴增,其擴增結果如圖4所不。

圖4 根霉Q1的18S rDNA序列PCR擴增結果Fig.4 PCR amplification result of 18S rDNA sequence of Rhizopus Q1

由圖4可知,根霉Q1擴增所得的18SrDNA基因片段在1 100 bp左右,與文獻報道[10,17]結果相符。

將PCR擴增產物純化后測序,所得序列登錄NCBI數據庫進行同源性比對,并選取同源性為97%以上的不同根霉種序列,采用MEGA 7.0進行比對,以NJ法構建系統進化樹,結果見圖5。

圖5 根霉Q1基于18S rDNA序列的系統進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of Rhizopus Q1 based on 18S rDNA sequence

由圖5可知,根霉Q1與米根霉(Rhizopusoryzae)CBS112.07以及米根霉CBS278.38聚于同一分支,說明Q1與米根霉親緣關系較近,屬于米根霉種。結合形態學與分子生物學的鑒定結果,鑒定菌株Q1為一株米根霉(Rhizopusoryzae)。

2.3 米根霉Q1在孝感米酒中的應用

2.3.1 孝感米酒理化指標的分析

米根霉Q1酒曲發酵36h后,孝感米酒中的還原糖含量、總糖含量、總酸度、酒精度、GABA含量測定結果見表3。

表3 孝感米酒理化指標的測定結果Table3 Determination results of physicochemical indexes of Xiaogan rice wine

由表3可知,米根霉Q1酒曲發酵得到的孝感米酒中總糖和還原糖含量高(均＞150 mg/g),總酸度適宜(＜10 mg/g),酒精度低(1.14%vol),符合孝感米酒的特點[27]。與2.1部分中結果相比,采用根霉酒曲釀造的米酒在發酵36 h后其還原糖含量和總酸度幾乎能達到接種根霉孢子液發酵米酒3 d的水平,說明酒曲釀造的米酒糖化效率高,糖化時間短,分析原因可能是酒曲中本身存在豐富的糖化酶等淀粉酶,且根霉在生長過程中又能分泌大量的糖化酶,故糖化效率高,糖化時間短。此外,米根霉Q1酒曲發酵的米酒中富含GABA,其含量可達73.75 mg/kg。

2.3.2 孝感米酒的感官評定

米根霉Q1酒曲釀造的孝感米酒發酵36 h后,對其氣味、口感、色澤和組織形態進行感官評定,結果表明其發酵的米酒無異味、微酸、味甜、有米酒典型香氣,符合孝感米酒的特點[27],感官得分為80分。

2.3.3 孝感米酒中揮發性風味成分分析

米根霉Q1酒曲發酵36 h后,采用GC-MS對孝感米酒中的揮發性風味成分進行分析,氣質譜圖經計算機和人工將每個峰與NIST Library相匹配檢索定性,匹配度＞80%作為鑒定結果;根據內標法對每種物質進行定量,其結果如表4所不。

由表4結果可知,在米根霉Q1酒曲發酵36h后得到的米酒中共檢測到54種揮發性風味物質,包括5種醇類、8種酯類、2種醛類、9種酮類、6種醚類、3種酸類、10種烷烴類、7種烯烴類和4種其他類;其中3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、苯乙醇、十四酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯、苯甲醛、壬醛等是米酒中的特征風味物質,這些風味物質尤其是酯類大多具有花香、水果香、甜香、發酵香等,賦予米酒獨特的香氣,如苯乙醇具有獨特的玫瑰、月季花香,苯甲醛呈杏仁香、堅果香,癸酸乙酯具有花香、葡萄果香等[28]。由此可以看出,利用該根霉菌釀造的孝感米酒風味成分比較豐富。

表4 孝感米酒中揮發性風味成分分析結果Table4 Analysis results of volatile flavor components in Xiaogan rice wine

續表

3 結論

本研究從孝感米酒酒曲中篩選到一株高產糖化酶的根霉菌Q1,通過形態觀察和18SrDNA序列分析將其鑒定為米根霉(Rhizopus oryzae)。將篩選到的高糖化力根霉菌Q1制成酒曲應用于孝感米酒的釀造,其發酵的米酒總糖(407.40 mg/g)、還原糖(221.74mg/g)和GABA(73.75 mg/kg)含量高,酸度(6.09 mg/g)適宜,酒精度(1.14%vol)低,感官鑒評(80分)好,且揮發性風味成分比較豐富,適合于孝感米酒的釀造,有利于提高孝感米酒的品質,同時也為米酒的釀造提供優良菌種資源。