致病性尖孢鐮刀拮抗菌的篩選與鑒定

王宇鵬,楊 帆,趙 華*

(天津科技大學 生物工程學院,天津 300457)

尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)是一種既可侵染植物又可在土壤內生存的兼性寄生真菌,屬半知菌類(Imperfectifungi)、從梗孢目(Moniliales)、瘤座孢科(Tuberculariaceae)、鐮刀菌屬(Fusarium)[1]。由致病性尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)侵染引起的植物枯萎病是一種世界性的土傳真菌病害。該病原菌在植株維管束組織內生長,使植株的營養和水分供應受到很大的影響,導致葉片氣孔關閉、葉片枯萎和植株整體死亡,最終病原菌到達死亡組織表面,然后在死亡組織表面產生大量孢子,進一步擴散為接種體[2]。尖孢鐮刀菌可引起100多種植物發生枯萎病,給作物生產帶來嚴重的損失。傳統防治措施由于長期大量施用化學農藥導致農藥殘留及環境污染,危害人類健康并破壞生態平衡,且隨著病原菌抗藥性的不斷增強,出現用藥量與病害發生程度相互遞增的惡性循環[3],因此,尋找健康、安全、有效的農業生物災害防治手段成為當務之急。

生物防治因其來源廣泛,對人畜安全和對環境友好而備受研究者的青睞,其中芽孢桿菌(Bacillus)具有培養周期短、生產方便、抗逆性較強、易于與其他藥劑混用等優點,日益成為生防菌的優勢菌源。李建嫄等[4]通過抑菌圈法和對峙平板法篩選出一株對花椒枯穗病病原菌具有抑制作用的多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa);楊冬靜等[5]通過研究發現解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)對甘薯黑斑病有很強的拮抗活性,而且對病原菌的菌絲體及孢子都具有致畸作用,對病原菌的萌發也有一定的影響;尹微等[6]通過驗證多粘類芽孢桿菌菌劑與腐植酸水溶肥料配合施用效果表明,二者配用顯著提高了黃瓜的產量及肥料的效果,對減輕土傳病害提高黃瓜產量有極其重要的作用。芽孢桿菌作為一類防治植物病害的重要生物資源,其主要抑菌物質來源于自身產生的蛋白[7]、脂肽[8]、揮發類物質[9],并能促使植株分泌一定的拮抗物質及促生長物質[10]。貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)作為一種新型生防菌,在2008年被確定為解淀粉芽孢桿菌的后期異型體[11]。除具有與解淀粉芽孢桿菌相似的拮抗作用和誘導植株抗性作用外,還能產生最佳乳化活性的生物表面活性劑,對后期在植物和土壤中定殖具有很大的應用價值[12]。

清香型白酒大曲中微生物含量高,菌體抗逆性較好,因此本研究以致病性尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)為靶標菌,從清香型白酒大曲中篩選一株對其具有拮抗作用的拮抗菌,進行菌落形態觀察、生理生化指標及16SrRNA鑒定,并對其生長曲線及抑菌物質做了初步研究,為后期生物防治應用提供菌種材料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

尖孢鐮刀菌(F.oxysporum):由本實驗室(天津科技大學工業發酵微生物重點實驗室)提供;清香型大曲粉:安徽省績溪縣龍川酒廠。

1.1.2 試劑

冰乙酸、氫氧化鈉、硫酸銨(均為分析純):天津市鼎盛鑫化工有限公司;瓊脂粉、孟加拉紅(均為分析純):北京索萊寶有限公司;葡萄糖、酵母膏、蛋白胨(均為分析純):北京奧博星生物技術有限責任公司;KH2PO4、Na2HPO4、KCl、NaCl(均為分析純):天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.1.3 培養基

LB培養基:酵母膏5.0g/L,蛋白胨10.0g/L,NaCl10.0g/L,pH為7.0。固體培養基時另添加15～20 g/L瓊脂粉,121℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養基:馬鈴薯浸出液200 g/L,葡萄糖20 g/L,pH自然。固體培養基時另添加15～20 g/L瓊脂粉,115℃滅菌30 min。

馬丁氏固體培養基:葡萄糖10.0 g/L,蛋白胨5.0 g/L,KH2PO41.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,孟加拉紅(10 g/L)3.3 mL,瓊脂粉15～20 g/L,pH自然,115℃滅菌30 min,臨用前每100 mL添加10 g/L鏈霉素液0.3 mL。

1.2 儀器與設備

H1815高速離心機:湘儀離心儀器有限公司;島津UV-1800紫外分光光度計:上海美譜達儀器有限公司;CX21FS1型生物顯微鏡:日本OLYMPUS會社;LRH-150-S恒溫恒濕培養箱:廣東省醫療器械廠;Lab-1D-50真空冷凍干燥機:北京博醫康實驗儀器有限公司;DYY-4C型穩壓穩流電泳儀:北京百晶生物技術有限公司;Mastercycler nexus聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)儀:德國Eppendorf公司;Tanon1600凝膠成像系統:上海天能科技有限公司;SY.45-NJB牛津杯(Φ6×8×10 mm):北京先驅威鋒技術開發公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離

稱取10 g大曲粉于100 mL無菌水中,加入玻璃珠后振蕩均勻,制備菌懸液;吸取1 mL菌懸液進行梯度稀釋,分別取稀釋梯度為10-2、10-3、10-4的菌懸液100 μL涂布于LB平板上,30℃條件下倒置培養2 d,整個實驗重復3次。挑選培養菌落形態不同且單一菌落,于LB平板上進一步劃線純化,將純化的菌株轉接到LB平板上,于4℃保存。

1.3.2 尖孢鐮刀拮抗菌的篩選

(1)初篩:將4℃保存的尖孢鐮刀菌轉接于PDA平板活化5 d,用滅菌打孔器在菌落邊緣區域制成直徑為5 mm的尖孢鐮刀菌餅置于PDA平板中心,同時將分離于大曲酒糟的菌株于LB固體平板培養基上進行三區劃線活化,30℃倒置培養24 h,然后分別使用無菌牙簽挑取單菌落點接拮抗菌于距離平板中心30 mm處的同一直線上,以接種尖孢鐮刀菌餅不接細菌的PDA平板為對照,30℃培養箱中培養5 d,觀察抑菌圈大小,并用卡尺采用十字交叉法測定抑菌圈直徑[14]。

(2)復篩:將4℃保存的尖孢鐮刀菌轉接于PDA平板上活化5 d,在菌落邊緣區域用滅菌打孔器制成直徑5 mm尖孢鐮刀菌餅,接種于PDA平板中央。取已活化的上述具有拮抗作用的拮抗菌株接種于LB液體培養基中,30℃、160 r/min培養48 h,6 000 r/min離心10 min除去菌體后收集發酵液,經真空冷凍干燥后用磷酸鹽(phosphatebuffer solution,PBS)緩沖液定容至10 mL,然后經微生物濾膜過濾,于距離平板中心30 mm處放置牛津杯,每個牛津杯中加入200μL無菌發酵液,30℃靜置培養5 d,測定抑菌圈直徑。

1.3.3 尖孢鐮刀菌拮抗菌株的鑒定

(1)形態學鑒定:將活化后的拮抗菌株劃線接種于LB平板上,30℃培養24 h,觀察菌落形態。挑取拮抗菌單菌落進行革蘭氏染色,并在顯微鏡下觀察細胞形態。

(2)生理生化鑒定:參考《常見細菌系統鑒定手冊》[15]對拮抗菌株進行生理生化鑒定。

(3)分子生物學鑒定:

脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)的提取:接菌株P9于3 mL LB培養基中過夜培養,6 000 r/min離心8 min,收集沉淀,800μL無菌生理鹽水重懸后混勻,再次離心并重懸于無菌TE緩沖液中,渦旋振蕩混勻,100℃水浴15 min,然后12 000 r/min離心5min,保留上清液備用。

PCR擴增:引物為細菌通用引物(27F與1492R)。PCR反應體系(25μL):模板1μL,上游引物1μL,下游引物1μL,10×PCRbuffer 2.5μL,脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTP)(2.5 mmol/L)2μL,Taq DNA聚合酶0.1μL,二甲基亞砜(10%)1μL,雙蒸水(ddH2O)16.4μL。PCR擴增條件:94℃預變性5 min;94℃變性30 s,53℃退火45 s,72℃延伸1 min,30個循環;72℃再延伸10 min。取2～5μL PCR擴增產物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進行驗證,PCR擴增產物于4℃保存備用。將PCR擴增產物送至蘇州金唯智生物工程有限公司進行測序。利用EZbioCloud數據庫對測序結果進行比對,選擇相似性較高的模式菌株序列,利用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹。

1.3.4尖孢鐮刀拮抗菌生長曲線的繪制

將已活化的尖孢鐮刀菌拮抗菌按3%接種量接種于裝液量為100 mL/250 mL的LB液體培養基中,每個菌株各設置一組平行和空白試驗。30℃、160 r/min搖瓶培養30 h,每隔3 h取樣,測培養液的OD600nm值,繪制菌種生長曲線。

1.3.5 尖孢鐮刀拮抗菌抑菌物質初探

(1)尖孢鐮刀菌孢子液制備:將4℃保存的尖孢鐮刀菌轉接于PDA平板,30℃培養5 d,然后用滅菌打孔器在菌落邊緣區域取直徑為5 mm的尖孢鐮刀菌菌餅,將菌餅放置于PDA平板中央,30℃恒溫培養5～6 d,取無菌生理鹽水進行水洗并刮下菌絲體,所得的水洗液經滅菌的4層濾布過濾即得真菌孢子液。

(2)尖孢鐮刀拮抗菌培養液的制備:取已活化的尖孢鐮刀拮抗菌轉接于LB液體培養基中,30℃、160 r/min培養9 h制備種子液,然后將種子液接種于LB液體培養基中,裝液量100 mL/250 mL,接種量為3%(V/V),30℃、160 r/min培養48 h,所得的培養液經10 000 r/min離心10 min,收集上清液。

(3)蛋白類物質提取:按照(2)所述收集上清,采用硫酸銨沉淀法[16-17]分別提取不同硫酸銨飽和度(25%、35%、45%、55%、65%、75%)的粗蛋白,將所得的粗蛋白用少量PBS緩沖液溶解,透析除鹽(透析袋截留分子質量為14 000 Da)后用PEG-8000進行脫水,最后定容至10 mL,經微生物濾膜(Φ=0.22μm)過濾收集到無菌EP管中,4℃保存。

(4)脂肽類物質提取:用6 mol/L的鹽酸將(2)中得到的上清液pH調節至2.0,采用酸沉淀法[18-19]提取脂肽物質,然后用PBS緩沖液溶解,并用NaOH調節pH為中性后再用PBS緩沖液定容至10 mL,經微生物濾膜(Φ=0.22μm)過濾收集到無菌EP管中,4℃保存。

(5)抑菌效果的測定:采用牛津杯法[20]測定抑菌能力,調整尖孢鐮刀菌孢子液的OD600nm值為0.6,吸取100μL孢子液均勻涂布于馬丁培養基,分別于距平板中心點20 mm處放置牛津杯,每個牛津杯中接入待檢測液體(尖孢鐮刀菌培養液、蛋白質類物質提取液、脂肽類物質提取液)200μL,30℃靜置培養2～3 d,觀察透明圈的有無并記錄抑菌圈的大小,當觀察到明顯的透明圈時表明該物質對尖孢鐮刀菌可以起到一定的抑制作用。

2 結果與分析

2.1 尖孢鐮刀拮抗菌的篩選

2.1.1 尖孢鐮刀拮抗菌的初篩

采用平板梯度稀釋法共篩選出105種菌落形態不同的菌株,經過初篩,共得到28株對尖孢鐮刀菌具有拮抗作用的菌株,其中9株抑菌效果比較好,編號分別為P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9。其抑菌圈直徑如表1所不。

由表1可知,所篩選的9株拮抗菌對尖孢鐮刀菌都具有一定的拮抗作用,其中P9的抑菌效果最好,其抑菌圈直徑可達到20 mm左右。

表1 拮抗菌對尖孢鐮刀菌的抑制作用Table1 Inhibitory effect of antagonistic bacteria on Fusarium oxysporum

2.1.2 尖孢鐮刀拮抗菌的復篩

分別取尖孢鐮刀拮抗菌P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9進行平板對峙拮抗實驗,觀察抑菌圈有無,并記錄抑菌圈大小,其結果如表2所不。

表2 拮抗菌的發酵液對尖孢鐮刀菌的抑制作用Table2 Inhibitory effect of fermentation broth of antagonistic bacteria on Fusarium oxysporum

由表2可知,所篩選的拮抗菌均具有抑菌效果,其中P2和P3的拮抗效果最差,其發酵液的抑菌圈直徑乃有8.1mm左右,P9的拮抗效果最好,其發酵液的抑菌圈可達到10mm左右,因此選用拮抗菌P9進行后續實驗。

2.2 尖孢鐮刀拮抗菌的鑒定

2.2.1 形態學鑒定

對拮抗菌P9進行革蘭氏染色、鏡檢及形態觀察,結果見圖1。

圖1 拮抗菌P9的菌落形態(A)與細胞形態(B)Fig.1 Colony(A)and cell morphology(B)of antagonistic bacterium P9

由圖1可知,菌株P9為革蘭氏陽性短桿菌,中生芽孢。菌落較大,呈不規則圓形,顏色為灰白色不透明,邊緣呈鋸齒狀,表面有褶皺,菌落中心有凸起。

2.2.2 生理生化鑒定

拮抗菌P9的生理生化試驗結果如表3所不。

表3 拮抗菌P9的生理生化特征Table3 Physiological and biochemical characteristics of antagonistic bacterium P9

根據伯杰氏手冊及常見微生物鑒定手冊[15]可知,該拮抗菌符合解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的生理生化特征。

2.2.3 分子生物學鑒定

拮抗菌株P9的16SrRNA擴增產物電泳結果如圖2所不。

圖2 拮抗菌P9 16S rRNA PCR擴增產物的電泳圖譜Fig.2 Electrophoregram of PCR amplification products of 16S rRNA of antagonistic bacterium P9

由圖2可知,在1 500～2 000 bp之間出現一條清晰且無彌散的條帶,說明得到了質量較高的擴增產物。然后將擴增產物送樣測序,采用EZbioCloud進行序列同源性比較,選取同源性較高的菌株,采用MEGA 7.0軟件構建該菌株的系統發育樹,結果如圖3所不。

由圖3可知,拮抗菌株P9與貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)聚于一個分支,親緣關系較近。結合形態觀察和生理生化特性,鑒定拮抗菌P9為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)。

圖3 基于拮抗菌P9 16S rRNA序列的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of antagonistic bacterium P9 based on 16S rRNA sequence

2.3 貝萊斯芽孢桿菌P9的生長曲線

貝萊斯芽孢桿菌P9的生長曲線如圖4所不。

圖4 貝萊斯芽孢桿菌P9的生長曲線Fig.4 Growth curve of Bacillus velezensis P9

由圖4可知,接種B.velezensis P9后,0～6h處于遲緩期,此時菌株生長緩慢;6～14h處于對數生長期,此時菌體數明顯增多,其中在第9小時生長速率最大。14～26 h為穩定期,14h時菌體的OD600nm值達到最大并基本保持穩定,菌體數不再增加,然后在第26小時進入衰亡期,菌體數量開始下降。

2.4 抑菌物質的初探結果

2.4.1 貝萊斯芽孢桿菌P9培養液對尖孢鐮刀菌的拮抗作用

以添加無菌水替代菌液作為對照,貝萊斯芽孢桿菌P9培養液對尖孢鐮刀菌的抑制效果如圖5所不。

圖5 貝萊斯芽孢桿菌P9發酵液對尖孢鐮刀菌的拮抗作用Fig.5 Inhibitory effect of fermentation broth of Bacillus velezensis P9 on Fusarium oxysporum

由圖5可知,B.velezensis P9在培養過程中能產生具有抑制尖孢鐮刀菌生長的代謝產物,該代謝產物主要分泌在胞外,其抑菌圈直徑為(10.3±0.2)mm。

2.4.2 蛋白類粗提液對尖孢鐮刀菌的拮抗作用

以添加無菌水作對照,無菌蛋白類粗提液對尖孢鐮刀菌的拮抗作用如圖6及表4所不。

圖6 粗蛋白對尖孢鐮刀菌的拮抗作用Fig.6 Inhibitory effect of crude protein on Fusarium oxysporum

表4 不同硫酸銨飽和度提取的蛋白對尖孢鐮刀菌的抑菌效果Table4 Antibacterial effect of protein extracted by different ammonium sulfate saturation on Fusarium oxysporum

由圖6及表4可知,硫酸銨飽和度在25%～75%范圍內析出的蛋白對尖孢鐮刀菌均有一定的拮抗作用(抑菌直徑均＞8.2 mm),其中硫酸銨飽和度達到65%時,抑菌效果最佳抑菌直徑可達(9.1±0.2)mm。因此,B.velezensis P9可代謝產生對尖孢鐮刀菌具有抑制作用的蛋白。

2.4.3 脂肽類粗提液對尖孢鐮刀菌的拮抗作用

以無菌水作為對照,無菌脂肽類粗提液對尖孢鐮刀菌的拮抗作用結果如圖7所不。

圖7 粗脂肽尖孢鐮刀菌的拮抗作用Fig.7 Inhibitory effect of crude lipopeptide on Fusarium oxysporum

由圖7可知,B.velezensis P9不僅能產生抗菌蛋白,而且也能產生抑菌脂肽類物質,其抑菌圈直徑為(8.8±0.2)mm。結果也表明,Bacillusvelezensis P9能通過分泌抗菌蛋白類物質和抑菌脂肽類物質共同作用實現對尖孢鐮刀菌的拮抗作用。

3 結論

從清香型白酒大曲中篩選出一株對尖孢鐮刀菌具有較強拮抗作用的芽孢桿菌,編號為P9。經形態學觀察、生理生化試驗及16SrRNA序列比對分析,鑒定菌株P9為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)。B.velezensis P9經過6 h的遲緩期后進入對數生長期,在第9小時生長速率達到最大,第14小時后進入平穩期。通過提取B.velezensis P9的抑菌物質發現,拮抗菌P9既能產生蛋白類物質進行抑菌,也能產生具有拮抗作用的脂肽類物質。