響應面法優化保加利亞乳桿菌微膠囊制備工藝

王偉潔,秦翠麗*,王大紅,2,伍家發

(1.河南科技大學 食品與生物工程學院,河南 洛陽 471023;2.洛陽市微生物發酵工程技術研究中心,河南 洛陽 471023)

乳酸菌在維持腸道菌群平衡、提高機體免疫力等方面具有重要作用,是食品領域的重要益生菌[1-3]。然而,由于乳酸菌對儲藏環境條件要求比較高、對人體消化道中胃酸和膽汁耐受性差,造成其產品中菌體易失活,不能有效到達腸道發揮益生作用[4-5]。因此,采取有效措施延長乳酸菌在產品中活菌存活時間、提高其在腸道中耐受性,對其有效發揮生物活性具有重要意義。乳酸菌微膠囊技術可以大大降低外界環境條件對菌體的影響,從而顯著提高菌體的抗逆性[6-7]。內源乳化法是一種常用的微膠囊技術,是將壁材、交聯劑(不溶性鈣鹽)及芯材的混合液分散到油相中,形成油包水(W/O)體系,然后加入酸使鈣離子解離并與壁材反應形成凝膠,對芯材進行包埋,可以使被包埋的芯材能夠抵抗外界環境因素的破壞,因操作簡便被廣泛應用于食品工業領域[8-10]。

關于內源乳化法制備乳酸菌微膠囊雖有一些研究[11-14],但將果膠和海藻酸鈉作為復合壁材與不溶性鈣鹽進行交聯反應的研究還鮮見報道。果膠作為常用的食品添加劑,具有生產成本低、安全性高且交聯度好的特點。因此,本試驗以保加利亞乳酸菌(Lactobacillusbulgaricus)為芯材,以海藻酸鈉和果膠為復合壁材,以碳酸鈣為交聯劑,采用內源乳化法制備保加利亞乳桿菌微膠囊,并通過響應面試驗對微膠囊制備工藝進行優化,為食品工業的實際生產提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus)ND02:河南科技大學食品與生物工程學院微生物實驗室保藏。

1.1.2 試劑

海藻酸鈉(食品級):鄭州盛義宏生物科技有限公司;碳酸鈣(食品級):南京松冠生物科技有限公司;果膠:江蘇銳陽生物科技有限公司;食用油:金龍魚集團;乳化劑Span-80:南通豐源化工有限公司。

1.1.3 培養基

MRS液體培養基:蛋白胨10 g,牛肉膏10 g,酵母粉5 g,葡萄糖20 g,吐溫-80 1 mL,磷酸氫二鉀2 g,醋酸鈉5 g,檸檬酸銨2 g,硫酸鎂0.2 g,硫酸錳0.2 g,加蒸餾水充分溶解后定容至1 L,115℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

DF-101S型磁力攪拌器:北京北分三普儀器有限公司;TS-100C型恒溫搖床:北京市永光明醫療器械有限公司;FY-1H-N型真空抽濾器:浙江飛越機電有限公司;LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌器:上海申安醫療器械廠;SW-CJ-1D型超凈工作臺:蘇州凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 保加利亞乳桿菌菌懸液制備

菌株活化:從保藏的斜面上刮取兩環保加利亞乳桿菌接種到MRS液體培養基中,于37℃靜置培養18～24 h,傳代2～3次,至活菌數達1×108CFU/mL。

菌懸液的制備:將活化后的保加利亞乳桿菌按3%(V/V)的接種量接入MRS液體培養基中,于37℃靜置培養16 h,重復傳代2～3次,6 000 r/min、4℃條件下離心10 min,收集菌體,用體積分數為0.9%的無菌生理鹽水洗滌2次,用無菌生理鹽水配制成一定濃度的菌懸液。

1.3.2 保加利亞乳桿菌微膠囊的制備

將芯材(保加利亞乳桿菌菌懸液)與一定濃度的壁材(海藻酸鈉、果膠)溶液混合均勻;加入CaCO3粉末,混勻;將混合液加入含一定濃度Span-80的食用油中(應邊加邊攪拌);再加入200μL冰醋酸,攪拌至微膠囊形成;加入250mL pH 5.5醋酸鹽緩沖液,靜置,使微膠囊沉降到醋酸鹽水溶液底部;去除上部油相,洗滌,收集微膠囊,4℃冰箱保存。

1.3.3 保加利亞乳桿菌微膠囊包埋率的測定

微膠囊崩解液的制備:依次將28.4g磷酸氫二鈉和19.2g檸檬酸溶于蒸餾水中,然后定容至1 L,并調節pH值為7.0,于115℃條件下滅菌30 min。

微膠囊包埋率的測定:取1.0 g微膠囊于50 mL微膠囊崩解液中,于37℃、180 r/min振蕩2.5 h,取l mL進行平板計數。微膠囊包埋率計算公式如下:

1.3.4 保加利亞乳桿菌微膠囊制備工藝優化

(1)保加利亞乳桿菌微膠囊制備工藝優化單因素試驗

以包埋率為評價指標,分別考察海藻酸鈉質量分數(1%、2%、3%、4%、5%)、海藻酸鈉與果膠質量比(5∶1、3∶1、1∶l、1∶3、1∶5)、水相油相體積比(1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶9)、碳酸鈣與壁材質量比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶6、1∶12)、乳化劑Span-80體積分數(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)、攪拌速率(200r/min、300 r/min、400 r/min、600 r/min、800 r/min)對保加利亞乳桿菌微膠囊包埋效果的影響。

(2)保加利亞乳桿菌微膠囊制備工藝響應面優化試驗

根據單因素試驗結果,以包埋率(Y)為響應值,選取海藻酸鈉質量分數(A)、海藻酸鈉與果膠質量比(B)、水相油相體積比(C)和碳酸鈣與壁材質量比(D)4個因素,進行4因素3水平的響應面分析試驗,確定最優的微膠囊制備工藝,設計因素與水平見表1。

表1 保加利亞乳桿菌微膠囊制備工藝優化響應面試驗因素與水平Table1 Factors and levels of response surface experiments for Lactobacillus bulgaricus microencapsulation preparation process optimization

2 結果與分析

2.1 保加利亞乳桿菌微膠囊制備工藝優化單因素試驗結果

2.1.1 海藻酸鈉質量分數對微膠囊包埋率的影響

海藻酸鈉質量分數對微膠囊包埋率影響結果見圖1。

圖1 海藻酸鈉質量分數對保加利亞乳桿菌微膠囊包埋率的影響Fig.1 Effect of sodium alginate mass fraction on encapsulation efficiency of Lactobacillus bulgaricus microencapsulation

由圖1可知,當海藻酸鈉質量分數為2%時微膠囊包埋率最高,達到89.7%。質量分數＜2%時,包埋率隨著海藻酸鈉質量分數的增加而逐漸增大,分析原因可能是當海藻酸鈉質量分數逐漸加大時,凝膠反應化速度逐漸提高,形成的微膠囊機械強度逐漸增加,包埋率由79.8%提高至89.7%;當海藻酸鈉質量分數＞2%之后,包埋率隨著質量分數的增加逐漸降低至75.4%,分析原因可能是隨著海藻酸鈉質量分數的繼續增加,反應體系的黏度與表面張力開始增大,導致需要包埋的菌體分散困難,從而引起包埋率降低[15]。因此,確定最優的海藻酸鈉質量分數為2%。

2.1.2 海藻酸鈉與果膠質量比對微膠囊包埋率的影響

海藻酸鈉與果膠質量比對微膠囊包埋率的影響結果見圖2。

圖2 海藻酸鈉與果膠質量比對保加利亞乳桿菌微膠囊包埋率的影響Fig.2 Effect of the mass ratio of sodium alginate and pectin on encapsulation efficiency of Lactobacillus bulgaricus microencapsulation

由圖2可知,當海藻酸鈉與果膠質量比為1∶1時微膠囊包埋率最高,達到82.4%。當質量比＞1∶1時,包埋率隨著質量比的減小由68.7%提高至82.4%,分析原因可能是當質量比較小時,海藻酸鈉的含量相對較低,反應體系黏度降低,菌體容易分散于壁材中,所以包埋率隨之升高;當質量比＜1∶1之后,包埋率隨著質量比的減小由82.4%降低至72.5%,分析原因可能是當質量比繼續減小時,果膠含量相對較高,使形成的微膠囊強度過大,導致被包埋在凝膠中的菌體不易被釋放出來,從而造成包埋率降低。因此,確定海藻酸鈉與果膠的最優質量比為1∶1。

2.1.3 水相油相體積比對微膠囊包埋率的影響

水相油相體積比對微膠囊包埋率的影響結果見圖3。

圖3 水相油相相體積比對保加利亞乳桿菌微膠囊包埋率的影響Fig.3 Effect of the volume ratio of water and oil phase on encapsulation efficiency of Lactobacillus bulgaricus microencapsulation

由圖3可知,當水相油相體積比為1∶3時微膠囊包埋率最高,達到89.2%。當體積比＞1∶3時,包埋率隨著水油相體積比的降低由75.8%提高至89.2%,分析原因可能是當體積比降低時,油相體積充足,壁材和芯材在油相中的分散和乳化反應更加充分,微膠囊包埋率隨之提高;但當體積比＜1∶3之后,包埋率隨著體積比的減小而逐漸降低,由最大值降低至77.6%,分析原因可能是當體積比繼續降低時,油相體積越來越大,形成的微膠囊顆粒因過于分散而越來越小,難以有效包埋乳酸菌,導致包埋率較低。因此,確定最優水相油相體積比為1∶3。

2.1.4 碳酸鈣與壁材質量比對微膠囊包埋率的影響

碳酸鈣與壁材質量比對微膠囊包埋率的影響結果見圖4。

圖4 碳酸鈣與海藻酸鈉質量比對保加利亞乳桿菌微膠囊包埋率的影響Fig.4 Effect of the mass ratio of calcium carbonate and sodium alginate on encapsulation efficiency of Lactobacillus bulgaricus microencapsulation

由圖4可知,當碳酸鈣與壁材質量比為1∶3時微膠囊包埋率最高,為82.4%。當質量比＞1∶3時,包埋率隨質量比減小由68.6%提高至82.4%,分析原因可能是當質量比減小時,壁材含量較高,鈣離子結合位點充分,可以大量生成微膠囊,包埋率也隨之提高;但是當質量比＜1∶3之后,包埋率隨質量比的減小而逐漸降低至72.6%,分析原因可能是當質量比繼續減小時,體系中與壁材發生交聯反應的鈣離子相對越來越少,交聯反應有限,無法包埋更多的乳桿菌,導致包埋率降低。因此,確定碳酸鈣與壁材的最優質量比為1∶3。

2.1.5 乳化劑體積分數對微膠囊包埋率的影響

乳化劑體積分數對微膠囊包埋率的影響結果見圖5。

圖5 乳化劑體積分數對保加利亞乳桿菌微膠囊包埋率的影響Fig.5 Effect of emulsifier volume fraction on encapsulation efficiency of Lactobacillus bulgaricus microencapsulation

由圖5可知,在乳化劑體積分數為1.5%時微膠囊的包埋率最高,為78.6%。當乳化劑體積分數＜1.5%時,微膠囊包埋率隨著乳化劑體積分數的增大而升高,由75.5%升高至78.6%,分析原因可能是因為乳化劑體積分數的增加使反應體系的表面張力增大,利于反應物分子的擴散,易于發生交聯反應;當乳化劑體積分數＞1.5%之后,微膠囊包埋率隨著乳化劑體積分數的增大逐漸降低,分析原因可能是水相和油相界面處乳化劑分子較多,阻礙冰醋酸順利通過,導致碳酸鈣解離困難,從而阻礙碳酸鈣與壁材之間的反應[16],導致微膠囊包埋率減小。因此,確定最優乳化劑體積分數為1.5%。

2.1.6 攪拌速率對微膠囊包埋率的影響

攪拌速率對微膠囊包埋率的影響結果見圖6。

圖6 攪拌速率對保加利亞乳桿菌微膠囊包埋率的影響Fig.6 Effect of stirring speed on encapsulation efficiency of Lactobacillus bulgaricus microencapsulation

由圖6可知,微膠囊包埋率隨著攪拌速率的增加呈增大趨勢,由72.3%提高至77.1%,分析原因可能是隨著攪拌速率的增大,溶液乳化更加充分,使得包埋率逐步提高。但當攪拌速率＞400 r/min之后,微膠囊包埋率增速變緩,分析原因可能是攪拌速率為400 r/min時,已能夠使溶液充分乳化,增加速率對微膠囊包埋效果無明顯影響[17]。因此,確定400 r/min為最優攪拌速率。

2.2 保加利亞乳桿菌微膠囊制備工藝條件優化響應面試驗結果

2.2.1 Box-Behnken試驗設計及結果

根據單因素試驗結果,選擇對包埋率影響較為顯著的因素海藻酸鈉質量分數(A)、海藻酸鈉與果膠質量比(B)、水相油相體積比(C)、碳酸鈣與壁材質量比(D)為變量,以包埋率(Y)為響應值進行響應面優化試驗,響應面試驗結果見表2,方差分析見表3。

利用軟件Expert Design 8.0對表2試驗結果進行分析,得到4個影響因素與包埋率之間的二次回歸方程:

表2 保加利亞乳桿菌微膠囊制備工藝條件優化響應面試驗設計與結果Table2 Design and results of response surface experiments for Lactobacillus bulgaricus microencapsulation preparation process optimization

表3 回歸模型方差分析Table3 Variance analysis of regression model

續表

由表3可知,微膠囊制備工藝的二次模型P=0.017 5＜0.05,說明該模型顯著(P＜0.05),失擬項P=0.054 3＞0.05,不顯著(P＞0.05),說明該模型可信度高,可以用于分析和預測保加利亞乳桿菌微膠囊制備工藝的優化程度?；貧w方程各項方差分析結果表明,4個因素對微膠囊包埋率的影響主次順序為海藻酸鈉與果膠質量比(B)＞碳酸鈣與壁材質量比(D)＞水相油相體積比(C)＞海藻酸鈉質量分數(A),交互項AD、BD、CD對響應值影響顯著(P＜0.05),交互項AB、AC、BC對響應值影響不顯著(P＞0.05);二次項A2對響應值影響極顯著(P＜0.01),B2、C2、D2對響應值影響不顯著(P＞0.05)。

2.2.2 模型驗證

通過回歸模型分析,得到保加利亞乳桿菌微膠囊制備的最佳工藝條件:海藻酸鈉質量分數1.89%,海藻酸鈉與果膠質量比1∶1,水相油相相體積比1∶2.59,碳酸鈣與壁材質量比1∶2.12,為方便操作,將以上數據修正為:海藻酸鈉質量分數為2%,海藻酸鈉與果膠質量比1∶1,水相油相體積比1∶2.5,碳酸鈣與壁材質量比1∶2,乳化劑Span-80體積分數1.5%,攪拌速率400 r/min,以此條件進行驗證試驗,3次試驗的平均包埋率為91.8%,基本與模型的預測值92.7%相符。

3 結論

通過單因素及響應面試驗優化了內源乳化法制備保加利亞乳桿菌微膠囊的工藝條件,得到最佳的工藝參數:海藻酸鈉質量分數2%,海藻酸鈉與果膠質量比1∶1,碳酸鈣與壁材質量比1∶2,水相油相體積比1∶2.5,乳化劑Span-80體積分數1.5%,攪拌速率400 r/min,在此優化條件下,微膠囊的包埋率達到91.8%。本研究優化的工藝參數可為食品工業的實際生產提供參考依據。