諾麗酵素抗氧化性能與蛋白質營養價值評價研究

陳小偉,程勇杰,薛淑龍,方 晟,張 婷,崔艷麗,毛建衛,沙如意*

(1.浙江科技學院 生物與化學工程學院 浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室 浙江省農業生物資源生化制造協同創新中心,浙江 杭州 310023;2.紹興文理學院 元培學院,浙江 紹興 312000;3.浙江大學 化學系,浙江 杭州 310027)

諾麗(noni)又名海巴戟、諾尼,屬茜草科(Rubiaceae),主要分布于南太平洋諸多島嶼和菲律賓等,在我國海南省、臺灣省和西沙群島地區也有分布[1]。諾麗果中含有豐富的蒽醌類、黃酮類、萜類、苯丙素類、糖苷類等生物活性物質[2-3],具有抗氧化[4]、保護心肌細胞[5-6]、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、鎮痛、降壓和抗炎等多種功效。諾麗汁對肝臟損傷具有一定的保護作用[7]。

食用植物酵素是以一種或多種新鮮蔬菜、水果和谷豆類、海藻類、食藥兩用本草類等食材為原料,加(或不加)糖類物質,經多種有益菌通過較長時間發酵而生產的功能性微生物發酵產品。植物酵素包含了植物本身的有效成分,經過微生物長時間的發酵,部分難以利用或無法利用的物質被降解為小分子物質,微生物的次級代謝產物及一些小分子成分能更好的被機體吸收和利用[8-10]。諾麗經發酵制備諾麗酵素的過程中,蛋白質、多糖等大分子物質逐漸被降解成容易吸收的氨基酸、肽類、寡糖、單糖等小分子組分。本研究對不同發酵時間諾麗酵素中的總酚、氨基酸、蛋白質等成分含量進行檢測,探索總酚和抗氧化能力之間的相關性,同時采用氨基酸比值系數法對諾麗酵素中的蛋白質營養價值進行評價,分析得出最符合人體蛋白質營養需求的較佳發酵時期,以期為科學地指導諾麗酵素的生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同發酵時間(360 d、450 d、720 d)的諾麗酵素發酵液:海南某企業提供;1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH):梯希愛(上海)化成工業發展有限公司;2,2-聯氮基-雙-二胺鹽[2,2'-azinobis(3-ethylbenzothi azoline-6-sulfonic acid)ammonium salt,ABTS]:上海長哲生物科技有限公司;三氯乙酸、沒食子酸、蒽酮(均為分析純),一水合檸檬酸、檸檬酸鈉、冰乙酸、重蒸酚(均為優級純):國藥集團化學試劑有限公司;γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)、混合氨基酸標準溶液(標準品):日本和光純藥工業株式會社。

1.2 儀器與設備

PTX-FA210型電子天平:福州華志科學儀器有限公司;PHS-3C型精密酸度計:杭州齊威儀器有限公司;N-1100SW/N-1100SF-W型斜式旋轉蒸發儀:東京理化器械株式會社;UV-5500PC型紫外分光光度計:上海市元析儀器有限公司;JT-DCY-12Y型水浴氮吹儀:杭州聚同電子有限公司;L-8900氨基酸分析儀:日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 總酚含量的測定

采用福林酚(Folin-Phenol)法[11]測定諾麗酵素發酵液中總酚含量。

標準曲線的繪制:準確配制100μg/mL、200μg/mL、300 μg/mL、400 μg/mL、500 μg/mL、600 μg/mL、700 μg/mL的不同質量濃度沒食子酸標準溶液。分別取0.5 mL標準溶液,加入10%(V/V)Folin-Phenol溶液2.5mL,充分振蕩混勻,在常溫下避光靜置3 min。反應結束后加入7.5%Na2CO3溶液2 mL,振蕩混勻,25℃、120 r/min避光反應1 h,以0.5 mL水作為空白調零,于波長765 nm條件下測定吸光度值。

樣品總酚含量的測定:取3種不同發酵時間的諾麗酵素發酵液,加水稀釋25倍,取0.5 mL稀釋液,參照曲線繪制方法測定總酚含量。

1.3.2 DPPH自由基清除能力的測定

參考SHARMA OP等[12]的方法,并略有改進。分別取5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL的不同發酵時間的諾麗發酵液于10 mL潔凈干燥的離心管中,加入去離子水補足至2 mL,再分別加入4 mL 0.1 mmol/L DPPH-甲醇溶液,置于25℃恒溫水浴中反應30 min,本底管中DPPH-甲醇溶液用甲醇取代。以去離子水調零,0.5 mg/mL維生素C(vitamin C,VC)作陽性對照,在波長517 nm條件下,檢測樣品吸光度值,DPPH自由基清除能力計算公式如下:

式中:A0為以去離子水為參比溶液的吸光度值,A1為樣品吸光度值,A2為本底管的吸光度值。

1.3.3 ABTS自由基清除能力的測定

參考OZGENM等[13]的方法,并略有改進。用5mmol/L的pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffer solution,PBS),將加入過硫酸鉀的ABTS稀釋到7 mmol/L,得到最終濃度為2.45 mmol/L的ABTS-PBS溶液,在暗處室溫放置12～16 h。在波長734nm處,使用前用PBS緩沖液將ABTS溶液稀釋至吸光度值0.70±0.02。

分別取1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL的諾麗酵素于10 mL潔凈干燥的離心管中,用5 mmol/L pH 7.4 PBS溶液補足至300μL,加入5 mL上述ABTS-PBS溶液,30℃條件下反應1 h,本底管中稀釋過的ABTS-PBS用PBS取代。以PBS調零,4 mg/mL維生素C(vitamin C,VC)作為陽性對照,在波長734 nm條件下檢測樣品吸光度值,ABTS自由基清除能力計算公式如下:

式中:A0為以去離子水為參比溶液的吸光度值,A1為樣品吸光度值,A2為本底管的吸光度值。

1.3.4 Fe3+還原力的測定

參考YILDIRIM A等[14]的方法并略有改進。取15μL、30μL、45μL、60μL、75μL的不同發酵時間的樣品于10mL潔凈干燥的離心管中,加入0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.6)補足至2.5 mL。再加入1%鐵氰化鉀水溶液2.5 mL,混合均勻,于50℃恒溫水浴鍋中反應30 min。反應結束加入10%三氯乙酸水溶液2.5mL,混勻,避光靜置10min。取2.5mL上清液加入含有2.5mL去離子水的潔凈離心管中,加入0.1%三氯化鐵水溶液0.5mL,混勻。以去離子水調零,0.5mg/mLVC作為陽性對照,在波長700 nm條件下,檢測樣品吸光度值。

1.3.5 可溶性蛋白質含量分析

采用考馬斯亮藍G250法測定諾麗酵素中的可溶性蛋白質含量[15]。

1.3.6 氨基酸含量測定

參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》檢測諾麗酵素中氨基酸的含量[16]。采用L-8900氨基酸分析儀,以檸檬酸鈉緩沖溶液為流動相;流速:0.4mL/min;分離柱柱溫:57℃;反應柱柱溫:135℃;進樣量:20μL;檢測波長:一通道570 nm,二通道440nm。諾麗酵素樣品稀釋25倍后,以峰面積作為檢測指標,采用外標法計算氨基酸含量。

1.3.7 氨基酸評分

通過測定不同發酵時間諾麗酵素發酵液中各種氨基酸的含量,采用聯合國糧農組織(food and agriculture organization of theunited nations,FAO)和世界衛生組織(world healthorganization,WHO)提議的必需氨基酸模式評價蛋白質的營養價值,計算樣品中的氨基酸得分(aminoacid score,AAS)與必需氨基酸的比值(ratio of amino acid,RAA),其中AAS值越接近于100%,蛋白質營養價值越高。氨基酸比值系數(ratio coefficient of amino acid,RC)主要用于表征樣品中氨基酸含量與模式中氨基酸含量相對偏離的程度,RAA及RC的數值越趨向1,則表不該樣品的氨基酸越接近WHO/FAO的推薦值;氨基酸比值系數分(score of ratio coefficient of amino acid,SRC)作為另外一種評判營養價值的指標,其值越接近100,表明該樣品中必需氨基酸的含量越均衡,營養價值就越高。其計算公式如下:

1.3.8 數據統計和分析

各個時間點不同指標的測定,實驗重復次數n=3,數據統計和分析采用SPSS18.0軟件,顯著性分析采用方差方法。

2 結果與分析

2.1 諾麗酵素總酚含量與抗氧化性能評價

根據不同質量濃度沒食子酸水溶液制作的標準曲線,結果見圖1。由圖1可知,吸光度值與沒食子酸質量濃度呈現出良好的線性關系,線性方程y=0.0096x+0.0256,相關系數R2=0.9992。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

不同發酵時間諾麗酵素發酵液中總酚含量如圖2所不。由圖2可知,隨著發酵時間的延長,總酚含量有輕微的增加,但提高并不顯著(P＞0.05)?？赡苁且驗橹Z麗果中的總酚會降解成單體酚,另一方面,微生物的代謝作用也會產生新的酚類物質。蔣增良等[17]的研究中也發現葡萄酵素發酵過程中總酚含量在發酵過程中有較為明顯的上升,可能是因為大分子酚類物質分解成小分子酚類物質,導致總酚含量提高。

圖2 不同發酵時間諾麗酵素總酚含量Fig.2 Total phenolic content of noni Jiaosu with different fermentation time

2.1.1 DPPH自由基清除能力的評價

以0.5 mg/mL VC為參照物,對不同發酵時間的諾麗酵素DPPH自由基清除能力進行評價,結果如圖3所不。由圖3可知,隨著加樣體積的增加,對DPPH自由基的清除能力呈現較強的濃度依賴性,且表現出良好的線性關系,經擬合,不同發酵時間諾麗酵素發酵液加樣體積和DPPH自由基清除能力的線性相關系數分別為0.997 5、0.995 3和0.989 2。不同發酵時間諾麗酵素在加樣量為30μL時,對DPPH自由基清除率均在65%左右,但不同發酵時間的抗氧化性能并無顯著性差異(P＞0.05)。發酵360 d、540 d和720 d的諾麗酵素半抑制濃度(half maximal inhibitoryconcentration,IC50)分別是0.684 mg VC/mL、0.698 mg VC/mL、0.667 mg VC/mL,對DPPH自由基清除能力從大到小依次是:VC(0.5mg/mL)＞720d諾麗酵素＞360d諾麗酵素＞540d諾麗酵素。

圖3 諾麗酵素對DPPH自由基清除能力Fig.3 DPPH radical scavenging ability of noni Jiaosu

2.1.2 ABTS自由基清除能力的評價

不同發酵時間諾麗酵素發酵液對ABTS自由基清除能力見圖4。由圖4可知,不同發酵時間諾麗酵素發酵液均表現出很強的ABTS自由基清除能力。發酵360d、540d和720d的諾麗酵素IC50分別為:3.453 mg VC/mL,3.493 mg VC/mL,3.937 mg VC/mL,ABTS自由基清除能力從大到小依次是:360 d諾麗酵素＞540 d諾麗酵素＞720 d諾麗酵素＞VC(4 mg/mL)。

式(2)約束條件表示變電站第N條饋線的最大負荷fN必須小于等于與之相聯絡且負荷裕度最大的兩條饋線的負荷裕度之和。因現場實際倒閘規范要求，這里暫只考慮兩條相聯絡線路，不考慮3條以上聯絡線路的情況。

2.1.3 Fe3+還原力的評價

以不同發酵時間諾麗酵素樣品質量濃度(x)和還原力(y)進行線性擬合,結果圖5所不。由圖5可知,隨著樣品質量濃度的升高,還原力升高,可見樣品劑量和還原力效應之間呈現出良好的線性關系,相關系數均＞0.995。半抑制濃度(50 inhibiting concentration,IC50)分析結果表明,還原力從大到小依次是:360 d諾麗酵素=720 d諾麗酵素＞540 d諾麗酵素＞VC(0.5 mg/mL),3個不同發酵時間點諾麗酵素的還原力并無顯著差異(P＞0.05),但還原力顯著高于0.5 mg/mL VC(P＜0.05)。

圖5 諾麗酵素對Fe3+還原力Fig.5 Reducing power for Fe3+of noni Jiaosu

綜上所述,不同發酵時間的諾麗酵素對于DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和還原力并未表現出明顯的差異(P＞0.05),說明發酵時間延長,其抗氧化性趨于平衡。不同發酵時間諾麗酵素總酚含量已趨于穩定,這也是在宏觀上表現出抗氧化性能趨于穩定的可能原因。

2.2 氨基酸與蛋白質營養評價

2.2.1 可溶性蛋白質與氨基酸含量

采用考馬斯亮藍法對不同發酵時間諾麗酵素中可溶性蛋白質含量進行測定結果見圖6。由圖6可知,三個不同發酵時間的諾麗酵素中可溶性蛋白質含量為3.70～4.00mg/mL,其中發酵720 d諾麗酵素蛋白質含量最高,達4.00 mg/mL。蔣增良等[18]對樹莓酵素發酵過程中的蛋白質含量變化研究發現,隨著發酵時間的延長,蛋白質含量有顯著上升(P＜0.05),在發酵第56天含量比發酵前增加了87.30%。張偉敏等[19]研究發現,諾麗果實中蛋白質質量濃度為8.09g/L,高于本研究所檢測到的諾麗酵素中蛋白質含量,可能是發酵工藝中的外加水和糖類等其它輔助物,導致蛋白質濃度相對下降。

圖6 3種不同發酵時間諾麗酵素中的蛋白質含量Fig.6 Protein contents of noni Jiaosu with 3 different fermentation time

氨基酸是構成蛋白質的基本物質,對3種不同發酵時間(360 d、540 d和720 d)的諾麗酵素中的17種蛋白質氨基酸以及非蛋白氨基酸GABA的含量進行測定,有利于系統性地評價蛋白質營養價值。3種不同發酵時間的諾麗酵素發酵液氨基酸分析圖譜見圖7。由圖7可知,17種蛋白氨基酸和非蛋白氨基酸GABA分離效果良好,Ⅰ、Ⅱ兩條基線分別為第一通道和第二通道,檢測波長分別為570 nm和440 nm,除脯氨酸(Pro)通過第二通道檢測,其他氨基酸均通過第一通道檢測。

圖7 不同發酵時間諾麗酵素發酵液氨基酸圖譜Fig.7 Chromatograms of amino acids of noni Jiaosu at different fermentation time

表1 諾麗酵素氨基酸種類和含量分析Table1 Analysis of types and concentration of amino acid for noni Jiaosu

2.2.2 必需氨基酸得分

3種酵素中均檢測出9種人體必需氨基酸,但蛋白質營養價值不僅與氨基酸種類有關,也與氨基酸的比例有關。本研究將3種酵素中的必需氨基酸與FAO/WHO模式氨基酸[22-23]做對比,計算氨基酸得分(AAS),結果見表2。

根據模式氨基酸評價方法,AAS值越接近于100%,蛋白質營養價值越高。由表2可知,諾麗酵素中除Met+Cys得分在100%～200%之間,其他氨基酸得分明顯高于1 000%,蛋白質營養嚴重過剩。3種諾麗酵素AAS平均值均＞1000%,其中發酵540d的諾麗酵素AAS值最高,平均值為1271.87%。

表2 諾麗酵素氨基酸得分結果Table2 Results of amino acid score of noni Jiaosu

2.2.3 蛋白質營養評價

氨基酸比值[23]定義為一定量食物中氨基酸的含量相當于模式氨基酸的倍數。氨基酸比值系數(RC)用于判定限制氨基酸和計算限制氨基酸的強化量。如果樣品中氨基酸的組成與模式氨基酸相等,則必需氨基酸的氨基酸比值(RAA)等于1,RC等于1。同理,當RC＜1,表不相應氨基酸相對不足;當RC＞1,則表不相應氨基酸相對過剩。比值系數分(SRC)主要用于蛋白質營養價值的評價。SRC描述了食物中各類必需氨基酸偏離氨基酸模式譜的離散度,其數值越接近100,表明該食品中各種必需氨基酸的含量越均衡[24]。

3種不同發酵時間諾麗酵素的RAA、RC和SRC值見表3。從表3可知,Met+Cys的RC值最小,為限制氨基酸;Leu和Lys的RC值＜1,氨基酸相對不足;此外,其他幾種氨基酸相對過剩;3種諾麗酵素SRC值均＞55,發酵過程中蛋白質營養均衡度有輕微下降,這可能是部分蛋白質作為微生物的營養源被消耗掉,可以通過在后期發酵過程中補加蛋白質營養來實現蛋白質相對穩定的含量。

表3 諾麗酵素RAA,RC與SRC值分析結果Table3 Analysis results of RAA,RC and SRC of noni Jiaosu

3 結論

本實驗對3種不同發酵時間的諾麗酵素中總酚含量和體外抗氧化活性進行研究,并以FAO/WHO建議的氨基酸評分標準對3種諾麗酵素的氨基酸和蛋白質營養進行評價。

3種酵素對DPPH自由基清除能力由高到低依次是:VC(0.5 mg/mL)＞720 d諾麗酵素＞360 d諾麗酵素＞540d諾麗酵素;對于體外ABTS自由基清除能力由高到低依次是:360 d諾麗酵素＞540 d諾麗酵素＞720 d諾麗酵素＞VC(4 mg/mL);對Fe3+還原力由高到低的順序依次是:360 d諾麗酵素=720d諾麗酵素＞540d諾麗酵素＞VC(0.5mg/mL)。從抗氧化指標上分析,發酵504 d和720 d的諾麗酵素相比發酵360 d的諾麗酵素并沒有呈現出顯著的優勢。

氨基酸分析結果表明,除Cys外,3種諾麗酵素均檢測出16種常見蛋白氨基酸和非蛋白氨基酸GABA,隨著發酵時間的延長,蛋白質含量有輕微下降,GABA含量有所上升。說明適當的延長發酵時間能使GABA富集。

3種諾麗酵素中必需氨基酸含量豐富,9種必需氨基酸AAS值均＞100%,蛋白質營養嚴重過剩。3種諾麗酵素SRC值均＞55,營養價值較高,但由于Met+Cys的缺乏,直接影響了諾麗酵素的營養均衡度,所以Met+Cys為第一限制性氨基酸。發酵過程中蛋白質營養諾麗酵素營養均衡度有輕微下降,導致蛋白質營養價值降低。說明單純從蛋白質營養價值來看,發酵時間的累積并沒有有效的改善諾麗酵素的營養價值。