正交試驗優選女士保健酒滲漉工藝

李 妍,梁慧珍,張長霞,蘇 靜,陳 鵬,賈士儒*

(1.天津科技大學 生物工程學院,天津 300457;2.天士力控股集團研究院健保食品開發中心,天津 300000)

保健酒已有數千年的歷史,是中國醫藥科學的重要組成部分[1]。女士保健酒的主要藥材有當歸、人參、黃精、玉竹、枸杞子、大棗,該配方具有調經止痛、補血活血、益氣安神的功效。其中人參為君藥,補氣安神[2];當歸、黃精、玉竹為臣藥,補腎益精[3-7];配伍枸杞子能滋補肝腎之陰[8];大棗在增強免疫力、抗腫瘤、抗氧化、改善心血管系統、造血等方面有著明顯藥理作用[9],王留等[10]研究了在日糧中添加1 500 mg/kg的大棗多糖能夠提高斷奶仔豬血液中超氧化物歧化酶的含量和總抗氧化能力,降低丙二醛含量。六味藥合用有抑制黑色素生長、抗氧化等功效。當歸中含有多種有機酸類化合物,其代表為阿魏酸[11]。阿魏酸效應物在較低濃度下能顯著降低酪氨酸酶的單酚酶活力,是一種強效的酪氨酸酶抑制劑[12]。5 mol/L的阿魏酸可有效抑制蝦血淋巴褐變,阿魏酸將蝦血淋巴中酪氨酸酶酶活抑制至5.97%[13]。人參提取液具有很強的抑菌消炎作用,是高檔化妝品的天然添加物,對婦女雀斑、褐斑、蝴蝶斑及老年皮膚色素沉著療效顯著[14]。劉戀等[15-17]研究了枸杞子水提物對酪氨酸酶活性的影響,枸杞子多糖對酪氨酸酶活性抑制能力很強,枸杞子水提物對酪氨酸酶具有明顯抑制作用,其半數抑制質量濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)為0.73 mg/mL。沈放等[18]研究了當歸多糖對酪氨酸酶活性的影響,結果表明當歸多糖對酪氨酸酶活性有較高的抑制作用,用體積分數為50%的乙醇提取當歸后的濃縮浸膏進行酪氨酸酶-多巴氧化實驗,當歸浸膏(1 g/L)的酪氨酸酶抑制率為35.8%[19],具有良好的美白功效。酪氨酸酶在黑色素細胞代謝過程中起著催化作用,引起黑色素分泌增多,因此抑制該酶的活性就能減少色素的生成[20]?，F有的活性成分提取方法包括浸提和滲漉,浸提現在最為常用,簡單方便,對設備要求比較低,能耗低,目前廣泛應用于工業生產,但得率不高,耗時長,限制保健酒的生產效率;與之相比較,滲漉屬于動態浸出方法,具有溶劑利用率高,有效成分浸出完全,可直接收集浸出液等優勢[21-22]。

本研究采用正交試驗,以阿魏酸、人參皂苷Rg1、Re及粗多糖含量為代表性指標并進行多指標綜合評分,對女士保健酒中當歸、人參、枸杞子、黃精、玉竹、大棗藥材的滲漉工藝進行優化,為最佳滲漉工藝參數的確立提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 藥材

實驗所用藥材見表1。經檢驗,所用藥材均符合《中國藥典》(2015年版一部)的規定。

表1 實驗所用藥材Table1 Medicinal materials used in the experiment

1.1.2 化學試劑

食用酒精(純度95.2%):吉林省新天龍實業股份有限公司;磷酸(色譜純):上海晶都生物技術有限公司;乙腈(色譜純):美國OMNI公司;鹽酸(分析純):天津市風船化學試劑科技有限公司;酒石酸鉀鈉(分析純)、亞鐵氰化鉀(分析純):天津威晨化學試劑科貿有限公司;硫酸銅(分析純)、無水葡萄糖(純度98.0%)、氫氧化鈉(分析純)、亞甲基藍(指不劑):天津市化學試劑一廠;人參皂苷Rg1(純度91.7%)、人參皂苷Re(純度98.0%)、阿魏酸(純度99.0%):中國食品藥品檢定研究院;甲醇(色譜純):德國默克股份兩合有限公司。

1.2 儀器與設備

Venusil MPC C18(2)色譜柱:天津博納艾杰爾科技有限公司;KQ-250E型超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司;安捷倫1260高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀:美國安捷倫公司;Milli-Q超純水處理系統:北京艾澤信科技有限公司密理博北京代理;歐美國家進口膜(尼龍膜):天津市津騰實驗設備有限公司;XS105型十萬分之一天平:梅特勒-托利多儀器上海有限公司;DL-I-15臺式封閉電爐:天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 滲漉工藝優化單因素試驗

影響滲漉工藝的主要因素有滲漉溫度、滲漉流速、滲漉前浸泡時間。在正交試驗前,首先進行滲漉溫度(4℃、20℃、25℃、30℃、35℃)、滲漉流速(0.2mL/min、0.4mL/min、0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min)、滲漉前浸泡時間(8 h、12 h、24 h、36 h、48 h)單因素試驗,對滲漉工藝的因素與水平進行初步篩選。

1.3.2 滲漉工藝優化正交試驗

在單因素試驗基礎上,以滲漉溫度(A)、滲漉流速(B)、滲漉前浸泡時間(C)為影響因素,阿魏酸、人參皂苷Rg1、Re和粗多糖含量為考察指標,優化滲漉工藝,正交試驗因素與水平見表2。

表2 滲漉工藝優化正交試驗因素與水平Table2 Factors and levels of orthogonal tests for percolation process optimization

1.3.3 考察指標的確定及評價方法

女士保健酒中的當歸、人參、枸杞子、大棗、玉竹和黃精具有較多生物活性成分,其中代表性成分有阿魏酸,人參皂苷Rg1、Re和粗多糖。故在滲漉工藝中以阿魏酸含量、人參皂苷Rg1、Re含量和粗多糖含量為評價指標進行綜合評分,以考察提取是否完全。

本課題研究采用多指標試驗簡易綜合評分法,可化多指標為單指標。阿魏酸、人參皂苷Rg1、Re和粗多糖的含量除以各自的標準差,乘以各自的權重系數。

確定權重系數:考慮到女士保健酒六味藥的君臣佐使關系及所含功效成分的特點,選擇阿魏酸、人參皂苷Rg1、Re和粗多糖作為評價指標。根據主成分權重系數大原則,阿魏酸含量(ai)(權重系數為0.30)、人參皂苷Rg1含量(bi)(權重系數為0.15)、人參皂苷Re含量(ci)(權重系數為0.15)和粗多糖含量(di)(權重系數為0.40),進行綜合評分(xi)[23],其計算公式如下:

式中:xi為綜合評分,分;ai為阿魏酸含量,mg/L;bi為人參皂苷Rg1含量,mg/L;ci為人參皂苷Re含量,mg/L;di為粗多糖含量,mg/L;s1,s2,s3,s4依次為阿魏酸、人參皂苷Rg1、Re和粗多糖測定含量的標準差。

1.3.4 阿魏酸含量的測定[24]

采用高效液相色譜法測定阿魏酸含量。

色譜條件:Venusil MPC18(2)色譜柱(4.60mm×250mm,5μm),流動相:乙腈-0.085%磷酸溶液(17∶83,V/V);檢測波長為316 nm;柱溫35℃,流速0.80 mL/min,進樣量:10μL。

對照品溶液的制備:精密稱取阿魏酸對照品適量,置于棕色量瓶中,加體積分數為70%甲醇制成0.036 mg/mL的阿魏酸標準溶液。供試品溶液的制備:取酒液樣品過0.45μm膜濾。

測定方法:精密吸取已配制質量濃度為0.036mg/mL的對照品溶液0.10 mL、0.70 mL、1.40 mL、2.10 mL、2.80 mL、3.50 mL,分別于5 mL容量瓶中,加體積分數為70%甲醇稀釋至刻度,搖勻,分別進樣10μL,記錄色譜圖和峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標,阿魏酸質量濃度(X)為橫坐標,繪制標準曲線,得線性回歸方程為Y=63 989X-0.767 6,相關系數R2=0.999 9。另精密吸取供試品溶液10μL注入HPLC色譜儀,記錄峰面積;分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL,注入液相色譜儀測定,按照標準曲線回歸方程計算樣品中阿魏酸含量。

1.3.5 人參皂苷Rg1和人參皂苷Re含量的測定

采用高效液相色譜法測定人參皂苷Rg1和人參皂苷Re含量。

色譜條件:Venusil MPC18(2)色譜柱(4.60mm×250mm,5μm),流動相:乙腈-0.05%磷酸溶液(V/V);檢測波長為316 nm;柱溫35℃,進樣量:10μL。梯度洗脫條件見表3。

表3 高效液相色譜流動相梯度洗脫條件Table3 Gradient elution conditions for mobile phase of HPLC

對照品溶液的制備:精密稱取人參皂苷Rg1對照品和人參皂苷Re對照品,加色譜級甲醇制成0.20mg/mL的溶液。供試品溶液的制備:取酒液樣品過0.45μm膜濾。

測定方法:取已配制質量濃度為0.11mg/mL、0.20mg/mL、0.30 mg/mL、0.45 mg/mL、0.55 mg/mL的Rg1對照品溶液,分別進樣10μL,記錄色譜圖和峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標,人參皂苷Rg1質量濃度(X)為橫坐標,繪制人參皂苷Rg1標準曲線,得線性回歸方程為Y=4 371.3X+10.224,R2=0.999 0。另精密吸取供試品溶液10μL注入HPLC色譜儀,記錄峰面積分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL,注入液相色譜儀測定,按照標準曲線回歸方程計算樣品中人參皂苷Rg1含量。

取已配制質量濃度為0.11 mg/mL、0.20 mg/mL、0.30 mg/mL、1.00 mg/mL、0.45 mg/mL、0.55 mg/mL的Re對照品溶液,分別進樣10μL,記錄色譜圖和峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標,人參皂苷Re質量濃度(X)為橫坐標,繪制人參皂苷Re標準曲線,得線性回歸方程為Y=3 733.3X+5.708 3,R2=0.999 0。另精密吸取供試品溶液10μL注入HPLC色譜儀,記錄峰面積分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL,注入液相色譜儀測定,按照標準曲線回歸方程計算樣品中人參皂苷Re含量。

1.3.6 粗多糖含量的測定

樣品粗多糖沉淀:準確吸取保健酒酒液5.00 mL,置于50 mL離心管中,加入20.00 mL無水乙醇,混勻,于4℃冰箱中靜置4 h以上,以9 000 r/min離心10 min,棄去上清液,殘渣用體積分數為80%乙醇溶液洗滌,離心后棄去上清液,反復操作3次。殘渣用水溶解并定容至100 mL。

葡萄糖標準曲線繪制:準確吸取葡萄糖標準溶液(2.5g/L)0.10mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL置于25mL比色管中,補水至2.00mL,加入5%苯酚溶液1.00mL,在漩渦混合器上混勻,加入硫酸10.00mL,在漩渦混合器上小心混勻,置沸水浴中2.00 min,冷卻至室溫,在485 nm波長處以實際空白為參比,測定吸光度值。以葡萄糖質量濃度(X)為橫坐標,吸光度值(Y)為縱坐標,繪制葡萄糖標準曲線,得線性回歸方程為Y=6.328 1X+0.007 5,R2=0.999 5。

樣品測定:準確吸取100μL置于25 mL比色管中,補加水至2.00 mL,然后按照葡萄糖標準曲線繪制中的測定方法進行吸光度值的測定,按照葡萄糖標準曲線回歸方程計算樣品中粗多糖含量。

2 結果與分析

2.1 滲漉工藝優化單因素試驗

2.1.1 滲漉溫度對滲漉工藝條件的影響

表4 溫度對滲漉工藝條件的影響Table4 Effect of temperature on percolation process conditions

由表4可知,滲漉流速在4～35℃范圍時,阿魏酸、人參皂甙Rg1和Re、粗多糖的含量隨溫度增大而增加;溫度為35℃時,阿魏酸、人參皂甙Rg1和Re、粗多糖的含量達到最大,分別為7.94mg/L、32.75mg/L、18.34mg/L、23658.46mg/L,藥材中的有效成分在較高溫度環境下更容易滲出。因此,選擇35℃為最佳滲漉溫度。

2.1.2 滲漉流速對滲漉工藝條件的影響

由表5可知,滲漉流速在0.20～0.80 mL/min范圍時,阿魏酸、人參皂甙Rg1和Re、粗多糖的含量隨滲漉流速增大而增加;滲漉流速為0.80 mL/min時,阿魏酸、人參皂甙Rg1和Re、粗多糖的含量達到最大,分別為6.01 mg/L、31.01 mg/L、17.95 mg/L、22 990.71 mg/L;滲漉流速＞0.80 mL/min之后,阿魏酸、人參皂甙Rg1和Re、粗多糖的含量均有所下降,原因是藥材中的有效成分來不及滲出,滲漉液白酒已經滴完。因此,選擇0.80 mL/min為最佳滲漉流速。

表5 滲漉流速對滲漉工藝條件的影響Table5 Effect of flow velocity on percolation process conditions

2.1.3 滲漉前浸泡時間對滲漉工藝條件的影響

表6 滲漉前浸泡時間對滲漉工藝條件的影響Table6 Effect of soak time before percolation on percolation process conditions

由表6可知,滲漉前浸泡時間在8～24 h范圍時,阿魏酸、人參皂甙Rg1和Re、粗多糖的含量隨滲漉前浸泡時間增大而增加;滲漉前浸泡時間為24 h時,阿魏酸、人參皂甙Rg1和Re、粗多糖的含量達到最大,分別為6.01 mg/L、31.01mg/L、17.95mg/L、22 990.71mg/L;滲漉前浸泡時間＞24 h之后,阿魏酸、人參皂甙Rg1和Re、粗多糖的含量均有所下降,藥材中的有效成分滲出到一定程度達到極限,不能繼續滲出,隨著滲漉前浸泡時間延長,有效成分反而減少。因此,選擇24 h為最佳滲漉前浸泡時間。

2.2 滲漉工藝優化正交設計試驗結果分析

9組滲漉完成后,經高效液相色譜及紫外分光光度計檢測阿魏酸、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和粗多糖含量如表7所不。

表7 樣品中各指標的測定結果(n=2)Table7 Determination results of each index in the samples(n=2)

按表7的試驗結果計算,阿魏酸的標準差s1為2.41,Rg1的標準差s2為1.13,Re的標準差s3為1.52,粗多糖的標準差s4為3559.75。通過簡易綜合評分法,將阿魏酸、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和粗多糖含量多指標為單指標,計算出結果。

表8 滲漉工藝優化正交試驗結果與分析Table8 Results and analysis of orthogonal tests for percolation process optimization

由表8可知,3個因素對阿魏酸含量、人參皂苷Rg1、Re含量和粗多糖含量均有影響,通過極差值得大小得出影響因素順序依次為A＞B＞C,說明影響女士保健酒滲漉工藝綜合評分中滲漉溫度和滲漉流速是主要因素,而滲漉前浸泡時間次之;由極差分析得出滲漉工藝最佳組合為A3B1C2,即滲漉溫度為36℃,滲漉流速為0.4 mL/min,滲漉前浸泡時間為24 h。

表9 正交試驗結果方差分析Table9 Variance analysis of orthogonal tests results

由表9可知,滲漉溫度和滲漉流速對結果影響顯著(P＜0.05),滲漉前浸泡時間對結果影響不顯著(P＞0.05)。

2.3 驗證試驗

為了進一步驗證正交試驗合理性按優選出的最佳工藝條件A3B1C2,重復進行3批樣品試驗。結果見表10。

由表10可知,3批樣品所提得阿魏酸含量、人參皂苷Rg1、Re含量和粗多糖含量都接近正交試驗中的36℃滲漉的最大值,表明此最佳工藝合理,可作為批量生產的工藝參數。

表10 驗證試驗結果Table10 Results of validation tests

3 結論

運用正交設計方法進行試驗,以求得最優的滲漉工藝。在所選因素水平范圍內,按綜合加權評分法判定,影響女士保健酒滲漉工藝的因素依次為A＞B＞C,即滲漉溫度＞滲漉流速＞滲漉前浸泡時間,且滲漉溫度和滲漉流速為提取過程中的顯著影響因素(P＜0.05)。又因為常溫滲漉節約能耗和生產成本。故最終選擇A3B1C2為最佳滲漉條件,即36℃滲漉、流速選擇0.4 mL/min、滲漉前浸泡時間選擇24 h。在此優化滲漉工藝條件下,綜合評分為9.66分,阿魏酸、人參皂苷Rg1、Re及粗多糖含量的分別為7.03 mg/L、31.86 mg/L、17.69 mg/L、22 647.20 mg/L。

本試驗以阿魏酸、人參皂苷Rg1和Re和粗多糖含量為評價指標,篩選滲漉工藝,有利于兼顧各指標的協同效應,符合中藥復方多成分多靶點起效的特點,較單一指標篩選更加科學、合理,而且操作方法簡便,結果容易統計,且優化后的滲漉工藝結果穩定可靠,可為進一步開發女士保健酒提供重要依據。