乙二醛和丁二酮抑制PhIP形成的作用機制研究

韓中惠，王曉敏，吳士瑩，張燕，王碩

（1．天津科技大學食品工程與生物技術學院，食品營養與安全國家重點實驗室，天津300457；2.南開大學醫學院，天津市食品科學與健康重點實驗室，天津300071）

熱加工可提高食品營養品質，改善食品營養消化率和延長食品保質期等[1]，但在熱加工過程中也會伴隨產生一些健康危害物，如雜環胺[2]、亞硝胺、丙烯酰胺[3]、呋喃[4]等。雜環胺是富含蛋白質的食物在熱加工過程中形成的具有多環芳香族結構的致癌致突變物的一類化合物。動物實驗證明這些雜環胺具有增加罹患結腸癌、胰腺癌、胃癌和食道癌等疾病的風險[5]。國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer，IARC）把八種雜環胺（包括2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑 [4，5-b]吡啶（2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4，5-b]pyridine，PhIP））列為 2 類致癌物[6]。針對肉制品中雜環胺的相關研究具有重要意義。到目前為止，已經從熱加工的肉類中分離鑒定了30多種的雜環胺[1]，其中2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4，5-b]吡啶（PhIP）是含量較高的一種[7]，所以 PhIP 經常作為研究雜環胺的代表物。

相關機制研究闡明，苯丙氨酸和肌酐是形成PhIP的必需前體物；苯乙醛是形成PhIP的關鍵中間體，由苯丙氨酸通過Strecker（斯特雷克）降解產生[1，8-9]。目前研究表明多酚類化合物[10-11]，酰胺化合物[10]和金屬陽離子[12]等物質都能顯著減少食品中PhIP的含量，其相關的抑制PhIP形成的機理也被闡明。研究人員證實不同種類的糖能夠抑制食品中雜環胺PhIP的產生，然而對于抑制機制鮮有報道[13-14]。我們的研究工作發現糖的降解產物α-二羰基化合物能夠顯著抑制PhIP的形成，并揭示了糖通過其降解產物丙酮醛抑制PhIP形成的作用機制[15]。乙二醛和丁二酮與丙酮醛同屬于α-二羰基化合物，均為糖降解產物，并對雜環胺PhIP的產生具有顯著的抑制作用，但并沒有研究揭示其抑制機制。因此，本文將系統分析在模擬體系中乙二醛和丁二酮抑制雜環胺PhIP形成的作用機制，為真實食品中雜環胺的形成控制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

PhIP標準品（98%）：加拿大 Toronto Research Chemicals公司；肌酐和苯丙氨酸標準品：美國Sigma-Aldrich公司；苯乙醛標準品：上海阿拉丁生化科技有限公司；乙二醛（40%水溶液）、丁二酮、肌酐和苯丙氨酸（均為分析純）：美國Sigma-Aldrich公司；甲酸銨和乙酸銨（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；AccQ-Tag試劑包：美國Waters公司。固相萃取柱HyperSep C18（200 mg/5 mL）：美國 Thermo Scientific 公司；固相萃取柱 Si-SCX-2（200 mg/5 mL）：美國 SILICYCLE公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 6410型高效液相色譜-三重四級桿質譜聯用儀（high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometer，HPLC-MS/MS）和 Agilent 7890B/977A型氣相-質譜聯用儀（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）：美國 Agilent公司；LC-20A型高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：日本 Shimadzu公司；12通道固相萃取儀：美國Sigma-Aldrich公司；RCT BS 25型磁力攪拌器和MS 3型渦旋混合器：德國IKA公司；FE20K型PH計：瑞士梅特勒-托利多公司；5804R型離心機：美國Beckman公司；MGS-2200型氮吹儀：日本東京理化公司；SBH200D/3型干浴加熱器：英國BIBBY公司。

1.3 模擬體系的建立

1.3.1 苯丙氨酸/肌酐/乙二醛（或丁二酮）模擬體系

分別取 0.01、0.05、0.1、0.5 mmol的乙二醛或丁二酮。將不同摩爾量的乙二醛（或丁二酮）、0.1 mmol的肌酐和0.1 mmol的苯丙氨酸分別置于螺口管中，加入3 mL二甘醇（86%）/水（14%）溶液中，然后在渦旋振蕩器上使其充分混勻溶解后放入干浴加熱器中。干浴加熱器溫度為130℃，加熱時間為120 min[15]。加熱反應結束后，取出樣品，放在冰水中冷卻至室溫待用。每組試驗重復進行3次。

1.3.2 苯丙氨酸/乙二醛（或丁二酮）和肌酐/乙二醛（或丁二酮）模擬體系

分別取 5、10、20、50、100 μmol的乙二醛或丁二酮。將不同摩爾量的乙二醛（或丁二酮）和0.1 mmol的苯丙氨酸或0.1 mmol的肌酐置于螺口管中，加入3 mL二甘醇（86%）/水（14%）溶液中，以下處理方式同1.3.1。

1.3.3 PhIP/乙二醛（或丁二酮）模擬體系

分別取 0.01、0.025、0.05 、0.1、0.25 μmol的乙二醛或丁二酮。將不同摩爾量的乙二醛（或丁二酮）和10 nmol的PhIP置于螺口管中，加入3mL二甘醇（86%）/水（14%）溶液中，以下處理方式同1.3.1。

1.4 試驗方法

1.4.1 標準溶液的配制

配制不同濃度的苯丙氨酸、苯乙醛、肌酐和PhIP標準溶液，將它們至于4℃的冰箱中避光保存備用。

1.4.2 苯丙氨酸的檢測

苯丙氨酸的測定使用的是AccQ·Tag方法[16]。首先使用配制Waters AccQ·Fluor衍生試劑對檢測樣品進行衍生，然后將衍生好的樣品待HPLC測定。

HPLC的色譜條件：色譜柱為Waters AccQ·Tag氨基酸分析柱 Nova-PakC18（3.9 mm×150 mm，4 μm）；柱溫為35℃；流速為0.8 mL/min；流動相：A為AccQ·Tag/水洗脫液（1/10，體積比），B為乙腈/水混合液（60/40，體積比）；檢測器為熒光檢測器，其激發波長為250 nm，發射波長為395 nm；進樣體積為1 μL。洗脫梯度如表1。

1.4.3 苯乙醛的檢測

將樣品使用適量的乙酸乙酯/己烷（3/1，體積比）提取3次。低溫下進行除有機溶劑，然后使用10 mL的乙酸乙酯定容，將制得的樣品過有機濾膜（0.22 μm），待GC-MS分析。

GC-MS分析方法是根據之前描述的方法進行一些修改[17]。氣質是由氣相色譜Agilent 7890B和質譜選擇檢測器（mass selective detector，MSD）5977A組成。樣品分離色譜柱 HP5-MS（30 m×0.25 nm×0.25 μm）；進樣的體積是1 μL。氣體為氦氣，載氣流速為1 mL/min，進樣口溫度為280℃，傳輸線到MSD的溫度為280℃。離子源溫度為230℃，質量范圍為50 amu～550 amu。色譜柱升溫程序：40℃保持1 min，然后以5℃/min到240℃，再以10℃/min升溫至280℃。

1.4.4 肌酐的檢測

將樣品進行50倍的稀釋，在將稀釋后的樣品進行水相濾膜過濾（0.22 μm），濾液待HPLC進行分析。

分析方法如前所述進行適當修改[18]。HPLC的色譜條件：色譜柱為 Kromasil C18（250 mm×4.6 mm×5 μm），流動相：A相為 25 mmol/L KH2PO4緩沖液（pH=6.9），B相為乙腈；10%B相等度洗脫；流速為0.8 mL/min；檢測器為紫外檢測器，檢測波長為215 nm；進樣體積為20 μL。

1.4.5 PhIP的檢測

樣品凈化參考實驗室已建立方法，試驗步驟如下[6，19]：采用丙磺酸陽離子（Si-SCX-2）交換柱和 C18 固相萃取柱串聯萃取，將樣品洗脫液用氮氣吹干然后用1 mL 色譜純甲醇復溶、稀釋，再離心（15 min，1 000 g）、過0.22 μm有機微孔過濾膜，待測。

HPLC-MS/MS的條件：色譜柱為Zorbax Eclipse Plus C18（2.1×150 nm，3.5 μm）；柱溫為 25 ℃；流速為0.2 mL/min；流動相：A 為甲酸銨（10 mol/L，pH=3.5），B為乙腈；洗脫梯度為：0～12 min，10%～60%（B相）；12 min～14 min，60%～10%（B 相）；進樣的體積為 1 μL；質譜使用電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）；霧化和碰撞的氣為氮氣；霧化氣壓力為0.28 MPa；毛細管電壓為4 000 V；干燥器流量為10 L/min；干燥器溫度為350℃；PhIP的質譜躍遷模式為m/z 225.3→m/z 210。

1.5 統計分析

試驗所得到的數據以平均值標準偏差（mean±SD）表示。其相關數據通過方差分析（analysis of variance，ANOVA）和鄧肯測試（Duncan test）。數據統計分析軟件為IBM SPSS 19.0。作圖軟件為OriginPro 2016。

2 結果與分析

2.1 檢測方法驗證

為確定測定結果的準確性，對苯丙氨酸、苯乙醛、肌酐和PhIP的方法進行了詳細的方法學考察。其中考察的指標包括線性回歸方程、檢出限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantilty，LOQ）回收率以及相對標準偏差。苯丙氨酸、苯乙醛、肌酐和PhIP標品的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，其線性回歸方程、線性相關系數r2、檢出限LOD和定量限LOQ如表2。

表2 苯丙氨酸、苯乙醛、肌酐和PhIP的線性回歸方程、相關系數及檢測限Table 2 Regression equations，correlation coefficients and detection limits for phenylalanine，phenylacetaldehyde，creatintine，and PhIP respectively

苯丙氨酸、苯乙醛、肌酐和PhIP在樣品中的回收率分別為85.9%～90.1%，75.6%～81.6%，70.5%～86.9%和75.1%～81.3%，相對標準偏差分別為1.8%～4.3%，2.3%～4.7%，4.3%～5.1%和3.7%～5.2%。試驗數據表明，測定苯丙氨酸、苯乙醛、肌酐和PhIP的方法具有較高的準確性和可靠性。

2.2 乙二醛和丁二酮對苯丙氨酸的影響

圖1顯示了乙二醛和丁二酮分別與苯丙氨酸反應后苯丙氨酸量的變化。

圖1 模擬體系中乙二醛和丁二酮對苯丙氨酸的影響Fig.1 Effects of glyoxal and diacety on phenylalanine（Phe）in model system

隨著乙二醛的逐漸添加，苯丙氨酸的量也逐漸降低，乙二醛添加量為100 μmol時，苯丙氨酸的濃度降低了（93.52±1.45）%。丁二酮對苯丙氨酸的影響與乙二醛一樣，也能使模擬體系中的苯丙氨酸濃度降低，當丁二酮的添加量為100 μmol時，苯丙氨酸的濃度降低了（99.71±0.72）%。以上結果表明乙二醛和丁二酮與苯丙氨酸發生了反應，消耗了苯丙氨酸的量。

苯丙氨酸是PhIP的關鍵前體物，乙二醛或丁二酮消耗苯丙氨酸的直接結果是導致PhIP形成的減少。但是有研究表明，將苯丙氨酸通過Strecker降解形成苯乙醛是形成PhIP的重要途徑，苯乙醛是形成PhIP的重要中間物[1，20]。因此，分析苯乙醛的變化是準確闡明乙二醛或丁二酮和苯丙氨酸的反應在PhIP形成中的作用的關鍵。

通過GC-MS分析，圖2顯示了乙二醛和丁二酮分別與苯丙氨酸反應后苯乙醛量的變化。

圖2 模擬體系中乙二醛和丁二酮對苯乙醛的影響Fig.2 Effects of glyoxal and diacety on phenylacetaldehyde（PEA）in model system

由圖2可知，當添加0～100 μmol的乙二醛后，苯乙醛的濃度增加至（0.026±0.002）μmol/mL，說明乙二醛可與苯丙氨酸反應形成苯乙醛。丁二酮與苯丙氨酸反應形成苯乙醛的量比乙二醛的量低（p＜0.05），但也能夠顯著促進苯乙醛的形成，且隨濃度變化而增加。

以上結果證實，苯丙氨酸可以通過乙二醛或丁二酮發生Strecker降解反應降解為苯乙醛[21]，而苯乙醛是形成PhIP關鍵的中間物，由此可見苯乙醛的增多可以促進PhIP的形成。因此，分析認為苯丙氨酸和乙二醛或丁二酮之間的反應不會有助于PhIP的減少，反而促進PhIP的形成。

2.3 乙二醛和丁二酮對肌酐的影響

圖3顯示了乙二醛和丁二酮分別與肌酐反應后肌酐量的變化。

由圖3可知，在肌酐/乙二醛（丁二酮）模型系統中，隨著乙二醛濃度從0～100 μmol增加，肌酐的濃度從（0.036±0.002）mmol/mL降至（0.021±0.001）mmol/mL。相同情況，隨著丁二酮加入量逐漸增加，肌酐的濃度也逐漸降低。以上結果表明，乙二醛和丁二酮都可以與形成PhIP的關鍵前體物肌酐發生反應，進而可使PhIP的形成水平降低。

圖3 模擬體系中乙二醛和丁二酮對肌酐的影響Fig.3 Effects of glyoxal and diacety on creatitine（Crn）in model system

2.4 乙二醛和丁二酮對PhIP的影響

圖4顯示了乙二醛和丁二酮分別與PhIP反應后PhIP量的變化。

由圖4可知，在模擬體系中，PhIP的量隨著乙二醛濃度的增加（從0～0.25 μmol）而顯著降低（p＜0.05），當在 0.05 μmol時 PhIP 降低（77.27±3.91）%，但是在 0.05 μmol～0.25 μmol之間 PhIP 的降低沒有顯著的變化（p＜0.05）。丁二酮與PhIP反應的變化趨勢與以上的情況相似，PhIP隨乙二醛添加量的增加而逐漸減少；但是減少量顯著低于乙二醛（p＜0.05）。通過以上乙二醛和丁二酮對PhIP的影響可以得出，此二種α-二羰基化合物能夠與PhIP發生化學反應，可促使PhIP減少。

圖4 模擬體系中乙二醛和丁二酮對PhIP的影響Fig.4 Effects of glyoxal and diacety on PhIP in model system

2.5 乙二醛和丁二酮對PhIP形成的抑制

以苯丙氨酸/肌酐/乙二醛和苯丙氨酸/肌酐/丁二酮模型系統來研究乙二醛和丁二酮對PhIP形成的影響。PhIP的量隨著乙二醛和丁二酮的濃度增加而下降[15]。這意味著乙二醛和丁二酮顯著減少了模型體系中PhIP的形成（p＜0.05）。這些結果證實，乙二醛和丁二酮在減少PhIP形成中起重要作用，這可能是由于乙二醛和丁二酮消耗PhIP或其前體物所致。

3 結論與討論

通過對不同模擬體系中前體物，中間體及產物的系統分析，初步推測了乙二醛和丁二酮抑制PhIP形成的作用機制。乙二醛和丁二酮可分別與苯丙氨酸、肌酐和PhIP發生化學反應，乙二醛、丁二酮與肌酐的反應，以及乙二醛、丁二酮與PhIP的反應可減少PhIP形成；相反，乙二醛、丁二酮與苯丙氨酸反應可促進PhIP前體物苯乙醛的形成進而促進PhIP形成，因此反應體系中PhIP的總體減少是這些化學反應的綜合作用結果。這與丙酮醛抑制PhIP的作用機制相同[15]。結合前期相關研究結果分析，進一步證明糖可通過熱降解形成α-二羰基化合物來實現對雜環胺PhIP的抑制作用。研究結論為建立食品加工中雜環胺的有效減控技術奠定了理論基礎。