Necrostatin-1對小鼠腦外傷腦組織損害及行為學能力的影響

王堯淇 常盼 吳娟 陳溪萍 陶陸陽

除凋亡(apoptosis)和壞死(Necrosis)兩種經典細胞死亡模式以外，很多學者研究表明在腦外傷或腦卒中的病理生理發生和發展過程中仍有其它的細胞死亡形式參與其中，如脹亡(oncosis)、自噬性死亡(autoschizis)、非凋亡性程序性細胞死亡(paraptosis)等[1]。腦外傷(traumatic brain injury，TBI)除外力直接作用導致腦實質挫傷、出血、水腫等直接原發損傷外，還有涉及多種分子生物效應如神經元和神經膠質細胞的死亡、代謝、修復過程等。近年來，關于細胞死亡過程信號轉導調控也成為中樞性神經系統損傷和疾病研究的熱點之一，對于探討減少神經細胞死亡和改善神經功能障礙的治療靶點具有重要意義。

研究發現，與程序性壞死密切相關的受體相關蛋白RIP-1能夠被Necrostatin-1(Nec-1)充分抑制，分子量為259.3，分子式為5-(Indol-3-ylmethyl)-(2-thio-3-methyl)hydantoin。You等使用Nec-1證明程序性壞死也是TBI誘發的細胞死亡的重要方式之一，除了先前發現的凋亡和自噬性細胞死亡外，在腦外傷后引起的程序性細胞死亡過程還包括程序性壞死(programmed necroptotic cell death,Necroptosis)[2]。我們已進行的研究表明，Nec-1除了能夠抑制腦外傷引起程序性壞死外，還可以進一步抑制自噬，從而揭示TBI誘導的不同細胞死亡方式可以存在一種“串話”機制，共同影響腦外傷的預后[3]。本研究利用形態學與行為學實驗方法，探討程序性壞死特異性抑制劑在腦外傷引起的小鼠組織缺損和行為能力(運動功能和學習能力)障礙中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年健康昆明小鼠，體重在25 g左右，共72只，隨機分為假手術(Sham)組，腦外傷+二甲基亞砜(DMSO)組，腦外傷+Nec-1(Nec-1)組，每組各24只。

1.2 藥物與試劑

Necrostatin-1(Nec-1,Sigma-Aldrich 公司)；二甲基亞砜[DMSO，生工生物工程(上海)股份有限公司]；4%水合氯醛[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.3 儀器

電子精密天平(AL104)，Mettler-Toledo公司；立體定位儀，美國Kopp’s公司；自動顱骨鉆，韓國Precision 公司；冰凍切片機，德國LEICA公司；光電子VI-470 CCD相機，美國Ludl Electronic Product公司；水迷宮，上海移數信息科技有限公司；自由落體打擊器，自制；爬桿工具，自制。

1.4 方法

1.4.1 小鼠定量腦外傷模型建立及分組

稱取小鼠重量，篩選使用25 g左右的成年健康小鼠，經腹腔注射4%水合氯醛(1 ml/100 g)麻醉，利用立體定位儀，將小鼠頭部固定好，充分剪毛，盡量暴露頭皮，用70%已用酒精消毒，手術刀取頭皮正中切口，長2.0 cm，右側頭顱骨膜采取頓性方法剝離，在頭部冠狀縫后、中線旁各1.0 mm位置用圓形鉆頭骨鉆鋸開一直徑5.0 mm骨窗，顯露硬腦膜，確保硬腦膜完整；擁有壓力傳感記錄儀、支座、引導桿、自由落體和液傳導撞筒等部分組裝成為改良的自由落體打擊腦外傷制模裝置；使用2個活塞封閉撞筒兩端，中空潤滑油潤滑，壓力傳感器通過側管連接；壓深調控桿和等張彈簧位于頂部活塞和撞筒之間，半徑2 mm的沖擊桿設置在底部活塞內側；當引導桿引導落體下降，撞擊上活塞，壓深調控桿可以讓上下活塞在設置范圍里移動，硬膜及腦組織被沖擊桿撞擊，撞擊時間和撞筒內壓，在撞擊時記錄；自由落體打擊器由支座、引導桿、砝碼、等張彈簧、液體傳導撞筒、壓力傳感記錄儀和沖擊桿等部分組成；撞筒上下端被2個活塞封閉，中間裝有潤滑油，通過側管接壓力傳感器；按照文獻[4]報道的方法，落體使用40 g砝碼，下落高度為20 cm，控制以金屬圓柱下降<2 mm，進行小鼠腦外傷造模，逐層消毒以預防創口感染，縫合頭皮。

DMSO 1 μL溶解配制成為Necrostatin-1(Nec-1，2.6 μg/μL)使用液，右側側腦室打擊前15 min注射，分組成為Nec-1組；溶劑DMSO 1 μL，打擊前15 min右側側腦室注射的小鼠，為DMSO組；假手術組(Sham組)僅切開頭皮、右頂部開骨窗，不致腦外傷。

1.4.2 爬桿試驗和水迷宮定位航行試驗

每組小鼠各15只，腦外傷后24 h開始進行爬桿試驗，進行7 d，然后進行水迷宮試驗；進行爬桿試驗時用手將小鼠的尾巴輕輕拎起，讓小鼠2個前爪抓住立柱間鐵絲線的中部，從前、左、右3個方向使每只小鼠重復操作3次，評分方法根據表1，取平均分。

表1 爬桿試驗評分標準

Morris水迷宮檢測系統包括一部圖像全自動采編處理系統(包括攝像機、錄像機、顯示器和分析軟件等)，1個大的盛有染料水的圓形水桶和供小鼠站立的平臺隱藏在水面下；水桶的高度為0.5 m，半徑0.6 m，平臺高度為0.3 m、直徑為15 cm，碳粉作為染料加入水內混合充分，調整水溫25 ℃左右，平臺位于水下，小鼠無法在行為學訓練過程中看到；將4個標記點在水桶內壁等距離設置，圓形水面便形成四個象限，第3象限的中央放置平臺，位于水面下1.5 cm；小鼠頭朝向桶壁分別在各象限放入水中，讓小鼠隨機游泳，在120 s內未搜尋到平臺，并站在臺上小鼠，可將小鼠牽拉到平臺上站立，訓練后小鼠要求能夠在平臺停留20 s以上，而后在進行下一次訓練；考察小鼠學習能力，必須進行數天時間的定位航行試驗(place navigation)，小鼠搜尋平臺的潛伏期進行記錄，用于評價。

外傷后第8 d小鼠開始第1次水迷宮實驗，每日進行1次，小鼠每次隨機選擇象限進入水中，并連續完成4個象限，連續7 d小鼠接受訓練，尋找水下平臺，并將小鼠找到平臺的時間(逃避潛伏期)記錄，后續2 d，將平臺顯露在水面以上，讓平臺在小鼠可視情形下進行測試。

1.4.3 腦組織缺損體積測量

選取Sham組、DMSO組和NEC-1組小鼠各9只；腦外傷后21 d，麻醉斷頭，解剖取出全腦，利用液氮將腦組織迅速冰凍15 s，然后再利用冰凍切片機進行切片，各組選擇一致斷面(切片厚度選擇12 μm，每個斷面250 μm，分為8個斷面)，蘇木精染色；等倍放大切片，使用VI-470 CCD光電子相機進行圖像采集，采集圖像后提取腦組織缺損區，將電子圖像導入電腦后利用Image-Pro Solution圖像處理軟件，測量未手術側皮質總的面積，Cavalieri方法確定損傷皮質體積占整個皮質體積的比例，計算公式腦組織損傷體積(%)=(健側體積-損傷側體積)/健側體積×100%。

1.4.4 統計學處理

試驗數據使用SPSS17.0統計軟件進行統計學分析和t檢驗。以P<0.05為存在統計學差異。

2 結 果

2.1 爬桿試驗

腦外傷后1 d DMSO組小鼠爬桿試驗評分較Sham組明顯降低(P<0.01)，傷后2～7 d評分回升，Nec-1側腦室預給藥可加快小鼠腦外傷后運動能力的恢復過程(P<0.05)(圖1)。

圖1 腦外傷后1～7 d各組爬桿試驗得分 與DMSO組比較,#P<0.01,*P<0.05

2.2 水迷宮試驗

小鼠腦外傷后第9～14 d DMSO組與Sham組比較，尋找平臺潛伏期更長(P<0.05)；與DMSO組比較，Nec-1組在腦外傷后第9～12 d搜尋平臺表現為更短的潛伏期(P<0.05) (圖2)。

圖2 腦外傷后8～16 d各組水迷宮定位航行潛伏期 與DMSO組比較,#P<0.05,*P<0.05

2.3 腦組織缺損體積測量

腦外傷后21 d DMSO組小鼠與sham組小鼠比較明顯可以見到部分腦組織缺損(P<0.01)，然而與DMSO組比較，Nec-1預處理能顯著減小腦外傷后腦組織缺損體積(P<0.05)(圖3)。

圖3 各組小鼠腦外傷后21 d腦組織缺損體積 與DMSO組比較,#P<0.01,*P<0.05

3 討 論

大量報道表明，腦外傷(TBI)除了可以造成腦組織直接破壞、神經細胞非程序性壞死外，還可以通過誘導神經元凋亡，觸發細胞死亡信號轉導，調控自噬或者程序性壞死等途徑，誘發神經細胞程序性死亡，進一步影響腦外傷后神經功能轉歸。研究證實，參與腦外傷后神經細胞損傷的病理機制主要涉及線粒體損傷及功能障礙、氧自由基產生、半胱天冬氨酸酶(caspases)系統激活、繼發性興奮性氨基酸受體激活、炎癥反應和內皮細胞功能紊亂等[5]。我們之前的研究已經發現，多種程序性細胞死亡方式參與了腦外傷后的信號調控且可以進一步影響腦外傷后的腦組織修復和神經功能恢復[6-7]。因此，研究腦外傷造成的神經細胞死亡必須考慮多種細胞信號轉導機制，而細胞死亡方式調控的研究也已經成為腦外傷的研究熱點之一，如果可以發現針對腦外傷后引起的多種生物信號的綜合干預手段，則有望形成更加完善的腦外傷綜合治療方案，對研究改善腦外傷后神經功能障礙具有重要意義。

近年來，學者發現壞死一定條件下也是可以受細胞信號調節的死亡方式，并非絕對消極的細胞死亡過程[8]。當caspase-8活性減弱就無法完全分解受體交互作用蛋白-1(RIP1)和受體交互作用蛋白-3(RIP3)，后者聚集而成的復合體能夠互相磷酸化彼此的死亡結構域，形成激活型RIP3，將細胞壞死信號向下游傳遞[9-10]。程序性壞死是受體介導非caspase依賴型程序性細胞死亡方式，多年研究發現，程序性壞死有以下特征：(1)組織學檢驗具有壞死形態特征，前期能夠見到細胞膜破壞；(2)同時下游信號轉導能夠產生自噬；(3)線粒體膜電位消失；(4)特定情況下可出現細胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)增加；(5)能夠被特異性抑制NEC-1拮抗，而凋亡抑制劑不能夠影響壞死過程[11-12]。

Necrostatin-1(NEC-1)被研究中證實是一種細胞受體交互作用蛋白激酶-1(RIP-1)的特異性抑制劑，能有效抑制程序性壞死[12-13]。我們之前的研究也在小鼠腦外傷模型上證實了腦外傷可以導致神經元死亡，而且程序性壞死抑制劑Nec-1可以減少腦外傷后的神經元死亡數目，說明程序性壞死參與了腦外傷后的神經元程序性死亡過程。我們研究還進一步表明，通過抑制程序性壞死可以同時抑制腦外傷后皮質組織和海馬組織中的自噬和凋亡，并且通過聯合使用自噬和凋亡特異性抑制劑，我們發現在小鼠腦外傷模型上抑制自噬可以同時抑制凋亡半胱天冬氨酸酶(caspases)系統的激活，達到同時抑制凋亡的效果，而單獨抑制凋亡，隨著凋亡活性的抑制，可同時引起微管相關蛋白1輕鏈3的-II(LC3-II)表達上調，自噬活性增加[3]，這進一步說明不同程序性細胞死亡方式在小鼠TBI后的細胞程序性死亡調控中也具有潛在的“串話”機制。小鼠腦外傷后神經功能的預后與多種細胞死亡方式調控有關，本研究結果表明在我們之前已有的研究基礎上又進一步證明抑制程序性壞死同樣也可以減少小鼠腦外傷后腦組織損傷體積，從而有利于小鼠腦外傷后腦組織形態的修復。本實驗也通過爬桿試驗和Morris水迷宮試驗進一步發現側腦室Nec-1預給藥可以起到改善腦外傷后運動功能和學習能力的效果。這也進一步提示程序性壞死的調控有望成為腦外傷新的治療靶點。