自噬標志物LC3B表達水平的改變與星形細胞瘤手術患者預后的相關性研究

王航 宋歌 劉永建 謝萬福

星形細胞瘤是人類最常見的腦腫瘤。世界衛生組織(WHO)[1]根據腫瘤的程度將星形細胞瘤分為4級，其中Ⅲ級和Ⅳ級腫瘤是高度惡性的，分別以間變性星形細胞瘤和多形性膠質母細胞瘤(GBM)為例，它是人類最常見和最惡性的原發性腦腫瘤。為了早預防早治療，進行了大量與星形細胞瘤的嚴重程度相關的生物標志物如環氧合酶-2[2]，胰島素樣生長因子結合蛋白[3]、肌醇[4]的表達水平影響星形細胞瘤進展的研究。然而相關的機制研究較少。

癌癥干細胞(cancer stem cell,CSC)是指具有干細胞特征的癌細胞，能夠自我更新，并且產生異質性的腫瘤[5]。膠質母細胞瘤中CSC細胞的放射性抗性和化療耐藥性已被確定[6-7]，這是患者臨床療效差的一個原因。CSCs對抗化療可能是因為CD133+細胞下調自噬相關蛋白[8]。

自噬構成了分解代謝機制，通過溶酶體降解不必要或功能失調的細胞組分[9]。最近的研究表明，自噬不僅在調控癌癥發展中發揮重要作用，而且在癌細胞對抗癌治療的反應方面也可能發揮作用[10-11]。隨后的研究還鑒定了微管相關蛋白1輕鏈3(Microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)[12-13]和Beclin-1[14-15]作為自噬的基本標記。其中LC3B是化療后晚期乳腺癌的預后指標[16]。

本研究評估星形細胞瘤患者中LC3B和Beclin-1的蛋白表達水平。同時，由于癌樣干細胞已被發現是新型抗癌療法的有吸引力的靶標[17-18]，本研究也分析了CD133在星形細胞瘤患者中的表達水平。

1 對象與方法

1.1 研究對象

根據手術記錄、醫療記錄、病理報告和MRI圖像，回顧性收集本院神經外科于2009年12月-2012年12月診斷的星形細胞瘤患者的218張薄切片。排除了免疫組織化學染色較差的樣本、病例記錄不完整或沒有隨訪資料的患者。最后本研究共選取106個樣本進行研究。本研究經本院評估委員會批準。

1.2 免疫組織化學染色

為了檢索免疫組織化學染色的抗原，福爾馬林固定，石蠟包埋的組織塊的3 μm切片脫石蠟，再水合，并在121 ℃的溫度下在pH9.0的目標回收溶液(Dako，Glostrup，丹麥)中高壓滅菌10 min；通過在室溫下在3%過氧化氫中孵育5 min來阻斷切片中的內源性過氧化物酶；然后將切片在Tris緩沖液(Dako，K9001)中洗滌并與1∶200稀釋的兔多克隆抗人CD133(Biorbyt，orb18124，UK)，Beclin-1(abcam，ab16998，USA)和LC3B (SANTACRUZE，sc-16755，歐洲)抗體在室溫下1 h；用Tris-緩沖溶液洗滌后將切片與綴合有辣根過氧化物酶的第二抗體在室溫下孵育30 min；隨后將載玻片在3,3-二氨基聯苯胺中孵育5 min，然后將梅耶蘇木精復染60 s，并用Entellan(產品編號HX247305，Merck)固定；在雙盲的情況下評估免疫組織化學染色的切片；Beclin-1和LC3B的染色評分如下：陰性：0分(沒有或<10%的腫瘤陽性細胞)；弱陽性：1分(腫瘤陽性細胞10%～30%)；陽性：2分(30%～70%的腫瘤陽性細胞)；強陽性：3分(70%～100%)。CD133染色評分為陰性：0分(如果65%的細胞被抗體染色)；弱陽性：1分(5%～20%，包括20%的染色細胞)；陽性：2分(20%～50%，包括50%的染色細胞)；強陽性：3分(>50%的染色細胞)[19]。對于統計分析，0分和1分定義為低表達組，2分和3分定義為高表達組[20]。同時從病例中獲取患者的年齡、性別、腫瘤分級、接受放療或化療的基本資料。

1.3 統計學處理

采用SPSS19.0 (SPSS，Chicago，IL，USA)；采用卡方檢驗分析Beclin-1和LC3B蛋白表達水平與臨床資料的關系；采用Kaplan-Meier法進行log-rank檢驗分析生存率。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 LC3B和Beclin-1蛋白表達水平與臨床參數的關系

圖1和圖2分別顯示了Beclin-1和LC3B的表達水平強弱，即低、中、高強度的免疫化學染色。星形細胞瘤患者的年齡、性別、腫瘤分級以及化療耐受性均未與Beclin-1蛋白表達水平有關系(表1)。LC3B蛋白表達水平與輻射或化療有關系(P=0.02)。沒有其他臨床參數與LC3B蛋白表達水平有關系(表1)。Beclin-1蛋白表達水平與患者其他的臨床參數無明顯關系，同時與患者輻射、化療也無明顯關系(表1)。

圖1 星形細胞瘤切片中Beclin-1蛋白表達水平的代表性免疫組織化學染色 A為0分,極低強度組;B為得分1,低強度組;C為得分2,中強度組;D為3分,高強度組(×100倍)

2.2 LC3B和Beclin-1蛋白表達水平與生存率的關系

Beclin-1蛋白表達水平與患者的總體生存率不相關(圖3)。相反，LC3B的免疫化學染色的高強度預測不良預后(圖4)。同樣，LC3B蛋白表達陰性或弱陽性表現出與高LC3B水平相似的生存曲線。LC3B表達的低水平和中等水平的生存率要比LC3B表達的高水平的生存率高(圖4)。

圖2 星形細胞瘤切片中LC3B蛋白表達水平的代表性免疫組織化學染色 A為0分,極低強度組;B為得分1,低強度組;C為得分2,中強度組;D為3分,高強度組(×100倍)

表1 Beclin-1和LC3B蛋白表達水平與臨床參數的關系

注：LC3B為微管相關蛋白1輕鏈3B型

圖3 使用Kaplan-Meier方法和log-rank檢驗評估Beclin-1蛋白表達水平與星形細胞瘤患者總生存率的關系(P>0.05)

圖4 使用Kaplan-Meier方法和log-rank檢驗評估LC3B蛋白表達水平與星形細胞瘤患者總生存率的關系 高強度的LC3B免疫組織化學染色預測不良預后;LC3B蛋白表達陰性也存在相似的生存曲線

2.3 CD133和LC3B表達水平在星形細胞瘤中的預后價值

圖5顯示了具有弱、低、中、高強度的CD133的代表性免疫化學染色切片。CD133和LC3B高表達的患者的總生存期為38個月，而CD133和LC3B兩者均為弱表達的患者的總生存期為170個月(圖6)。CD133和LC3B的高水平表達是星形細胞瘤預后不良的指標(P<0.05)。

圖5 在星形細胞瘤切片中代表性的免疫組織化學染色CD133(癌癥干細胞樣細胞標記物) A為0分,極低強度組;B為得分1,低強度組;C為得分2,中強度組;D為3分,高強度組(×100倍)

3 討 論

Ⅳ級星形細胞瘤是最常見的一類惡性原發性腦腫瘤，也是最具侵襲性的癌癥之一。先前的研究表明，癌癥干細胞樣細胞對放療或化療耐藥[6]，并且這些細胞的富集是預后不良的指征[21-23]。由于LC3B蛋白的表達水平與放療和化療的耐藥性相關(表1)，本研究評估了CD133與LC3B在總體生存中的表達。診斷后的中位生存期通常只有14個月[24]。GBM管理的標準治療包括手術切除、局灶放療、以及替莫唑胺等烷化劑治療[25]。然而這些治療方法并不能有效地提高GBM患者的存活率。因此，目前研究主要集中在探究預測患者預后的通路和分子標記方面上。

圖6 使用Kaplan-Meiermethod和log-rank檢驗評估CD133和LC3B蛋白表達水平的組合與星形細胞瘤患者的生存率的關系 CD133和LC3B高表達患者的平均總生存期為38個月,CD133和LC3B兩者均為弱表達的患者的平均總生存期為50個月

本研究發現自噬標志物LC3B的表達水平增高與星形細胞瘤患者的放療/化療有關，并且影響患者的生存率。此外，增加LC3B的表達以及增強的CD133水平也與不良預后顯著相關。有研究報道，自噬抑制劑可使肝癌干細胞(LCSCs)、乳腺癌細胞對腫瘤微環境更敏感，并可用于改善抗癌治療[24]。同樣，雷帕霉素在神經膠質瘤起始細胞中誘導自噬也增加了對輻射的敏感性[26]。

自噬構成了基本的分解代謝機制，其涉及通過溶酶體降解不必要或功能失調的細胞組分[9]。自噬是一把雙刃劍，一方面自噬可以上調自噬水平導致耐藥性的癌細胞的凋亡；另一方面惡性腫瘤細胞的轉移和擴散也離不開自噬的作用，腫瘤細胞在抵抗化療藥物殺傷過程中自噬也起到重要保護作用。通過激活自噬，選擇性識別和清除未折疊蛋白質和受損細胞器，從而避免凋亡作用發生[27]。

本研究發現，高水平的自噬標記物LC3B導致與放射和/或化學療法的抗性顯著相關。在我們的研究中增強的自噬是疾病進展的結果，而不是由其他研究者報道的化學誘導[26]。此外，本研究使用的細胞類型與其他研究中使用的細胞類型明顯不同，因為GBM對化療和放療高度耐藥。需要進一步的探究自噬標記物對星形膠質細胞的作用。本研究Beclin-1沒有表現出類LC3B的特性，對于Beclin-1的分析還需進一步研究。

有研究指出，由于自噬能力下調，GBM中LC3B-II和Beclin-1的表達水平降低[19]。與本研究結果一致，本研究還發現LC3B的高水平表達與不良預后相關。本研究結果表明，雖然沒有統計學意義，自噬減少會導致更晚期的星形細胞瘤。自噬在腫瘤發生中的作用是復雜的[27]。它一方面可以抑制腫瘤發生早期的腫瘤發展；另一方面自噬還可以促進已建立腫瘤的腫瘤進一步發展。本研究結果表明，高水平的LC3B表達或增強自噬與預后不良和自噬作為腫瘤啟動子的作用相一致。

最近，GBM癌癥干細胞已經被證明參與了腫瘤內皮的形成，增加了腫瘤的侵襲力，并且通過各種機制導致對放療的抵抗。本研究結果表明CD133(癌癥干細胞樣細胞標志物)和LC3B的高水平表達是星形細胞瘤預后不良的指征。這些結果表明，星形細胞瘤癌癥干細胞樣細胞和增強的自噬可引起對放射療法/化學療法的抗性，并且針對星形細胞瘤中的癌癥干細胞樣細胞可提供可行的治療方法。