解讀ISO 10993-4:2017《醫療器械生物學評價第4部分：與血液相互作用試驗選擇》

侯麗，喬春霞，趙增琳

山東省醫療器械產品質量檢驗中心/山東省醫療器械生物學評價重點實驗室，山東 濟南 250101

引言

血液相容性評價研究對于與血液接觸類的醫療器械非常重要，而國際標準ISO 10993-4:2017《醫療器械生物學評價第4部分：與血液相互作用試驗選擇》對醫療器械的血液相容性評價有重要的參考意義，因為它給出了評估器械和血液之間相互作用的一般要求和注意事項。本文件由國際標準化組織1992年頒布并于2002年進行了修訂（即ISO 10993-4:2002[1]）。但是，自2002年以來，該文件只進行了較少修改（即2006年發布的修改單）。由于血液相容性原理和實驗方法的復雜性，本文件并未涉及到標準化的評價方法和指標。過去幾年來，ISO/TC 194WG9工作組（血液相容性）收到了來自世界各地的數百條意見，經過反復討論和修改， ISO 10993-4:2017[2]在2017年4月正式批準發布，代表了當前國際上醫療器械血液相容性最新理念和研究進展。本文闡述了最新國際標準的變化，特別是一些當前國內外推薦的醫療器械較常用的血液相容性試驗，為國內醫療器械血液相容性評價工作的深入開展提供指導。

1 簡化評價流程圖

GB/T16886.1《醫療器械生物學評價 第1部分：評價與試驗》[3]中規定，對醫療器械新產品進行生物學評價以及上市后醫療器械重新進行生物學評價時，需要對材料進行理化表征以及根據器械是否與同類產品有相同的特性、與人體接觸特性和滅菌方法等工藝來確定器械是否需要進行生物學試驗。按照生物學評價流程，醫療器械新產品上市前的生物學評價或老產品重新評價后可能不必再進行生物學試驗。同樣，在ISO 10993-4:2017中進一步強調此理念并簡化了評價流程圖，特別是與血液直接或間接接觸的醫療器械新產品與合法銷售的、安全臨床使用史的器械相比（即材料、生產過程、幾何結構和理化性能、機體接觸/臨床使用、滅菌工藝/方法/劑量），以確定是否需要進行血液相容性試驗（圖1）。經過評價后，可能無需進行血液相容性試驗而直接得出滿足血液相互作用要求的結論，避免了忽視對已有數據的分析和評價及盲目試驗、過度依賴試驗結果的做法。但是值得注意的是，當器械引入新材料或改變產品工藝方法、增加新穎的器件設計特征、改變臨床應用時則可能仍然需要進行血液相容性試驗。流程圖的修訂將血液接觸器械的評價策略更加清晰，科學合理。

圖1 與血液相互作用試驗選擇判定流程圖

2 與血液相互作用試驗分類

血栓形成過程主要在體內或半體內條件下發生，在流動或靜止的血管或器械區域由凝血、血小板和白細胞激活產生。由于凝血、血小板和白細胞的激活可能會引發血栓形成，ISO 10993-4:2017提出將凝血、血小板、補體和血液學試驗作為血栓試驗的體外試驗，即在某些情況下，凝血、血小板、血液和補體的組合測試可作為血栓形成試驗的替代試驗。如果進行了體外試驗，可能沒有必要再做體內或半體內試驗（但醫療器械制造商應確認體外試驗替代體內試驗的適宜性）。由此，本次修訂將血液相互作用試驗類別由五類（血栓形成、凝血、血小板、血液學、補體系統）改為兩大類：溶血試驗（材料介導、機械介導）和血栓試驗（體外試驗和體內/半體內試驗）。這也是本版本較重要的修訂之處，即將ISO 10993-4:2002中表1和表2合并，并更新了外部接入器械和植入器械的舉例和使用試驗類別。比如，對外部介入類器械來說，溶血和血液學可能需同時評價而非分開單獨評價；對植入類器械來說，按照ISO 10993-4:2017中的要求，只需評價溶血試驗（材料介導和機械力介導）和體內或半體內血栓即可（表1）。

表1 與循環血液接觸器械或器械部件和適用試驗分類——外部接入器械和植入器械

3 血液相容性試驗方法

除修訂外，一些較少用或不適合醫療器械的試驗項目被確定為不常用和不推薦試驗的候選。此外，還發展和新增一些新的血液相容性試驗方法。隨著對血液相容性研究水平的不斷提高，新技術和新方法得到完善與發展，尤其是一些商品化試劑盒的開發，積累了豐富的數據，為評估指標的選擇提供了良好的基礎。本次修訂簡化了血液相容性試驗常用的試驗選擇，將ISO 10993-4:2002中表3和表4整合成新的表，見表2中血栓試驗項目。值得注意的是，將結果與適當的對照（陰性對照）以及相同設計、材料和臨床使用的已上市器械/材料的結果進行比較至關重要。

4 血栓試驗

當材料與血液接觸時，材料表面吸附以蛋白質為主的生物分子，緊接著發生的是同血小板和凝血因子激活為主、補體和白細胞激活為輔的一系列的反應，產生表面血栓和炎性反應等機體反應，故凝血、血小板激活、補體、血液學指標與血栓形成過程密切相關。較上一版相比，ISO 10993-4:2017重要的變化是明確將血栓試驗分為體外試驗和體內試驗，即將凝血、血小板激活、補體、血液學指標作為體外血栓的指標。在很多情況下，如果進行臨床相關的體外血栓試驗，沒有必要再進行體內或半體內試驗，這表明將有更多的機會進行有意義的體外試驗來替代或補充動物試驗。反之，如果進行體內血栓形成試驗得到了最終的血栓形成結果，也不需要再評價血小板激活、凝血等血栓起始階段的指標。

表2 醫療器械與血液相互作用

4.1 體內試驗

體內試驗與體外試驗相比，更能模擬臨床最終用途，但由于與血液接觸的醫療器械應用的多樣性，決定了體內測試模型的多樣性，因此選擇合適的動物模型、種屬差異性、試驗成本、動物倫理以及缺乏相應的種屬特異性的試劑盒等因素制約了體內試驗的進行。對于體內植入的器械進行體內試驗時，選擇終產品或其部件，應盡可能地模擬臨床實際使用條件，如植入部位、幾何形狀、接觸周期、血流情況、無菌操作、抗凝過程等。另外，使用的抗凝劑類型與說明書中的類型和劑量也需要保持一致。

對于要在無抗凝或抗凝條件下靜脈環境內植入的導管狀器械，特別是評價新導管或新涂層、表征新材料、改變材料供應商、改變工藝的情況時，可選擇非抗凝靜脈植入模型和抗凝靜脈植入模型，即在無或有抗凝劑的情況下，將植入物放置于大型動物（通常為2～3只）靜脈至4 h。最常用犬股或頸靜脈模型，測試材料/器械位于一側靜脈，對照材料或已上市對照器械放置在對側部位。為防止器械—器械相互作用和/或血栓形成位置差異帶來的偏差，通常采用交替試驗和對照的植入位置。測試器械的結果宜等于或小于已上市對照產品的血栓形成。必要時可定制合適的器械樣品以保證置入最多15 cm部件長度，同時保證與最終器械相同的材料比例。本版標準還特別指出，植入部位、植入技術、器械—血管壁接觸程度、時間/接觸期、材料表面狀態、取出技術、植入物尺寸相對于血管直徑的比例、抗凝劑等因素均對體內血栓試驗有較大的影響，但由于器械種類的多樣性、實驗動物和操作者之間的差異以及當前認知水平的限制，目前還無法對植入模型建立標準化的方法。

試驗完成后通過器械表面血栓情況（也可分析觀察到的血栓重量和血管通暢性作為補充分析）、末端器官（如肺和腎）的血栓情況以及相關的血液分析進行評價，見（表2）。

4.2 體外試驗

正如ISO10993其他部分一樣，體外試驗是評價醫療器械和材料的生物安全性有效的篩選工具。在進行動物試驗和臨床研究前，推薦接觸血液的醫療器械從早期設計、材料選擇及幾何形狀直到最終成品測試產品開發周期階段中進行廣泛的體外測試。體外試驗需要考慮并規范的試驗因素為試驗系統中全血的體積、血液接觸時間、血液溫度、血流狀況、抗凝劑類型和水平、試驗系統本身接觸血液的表面積以及與血液接觸比例等。試驗材料/器械與血液的接觸條件越接近臨床應用，評價結果的預測性越高。接觸后，可根據器械特點選擇一個或多個試驗類別進行測試，即凝血、血小板、血液學和補體系統等[4]。

4.2.1 凝血試驗

凝血途徑包括接觸激活途徑（內源性途徑）、組織因子途徑（外源性途徑）以及內外源凝血的共同凝血途徑，其中凝血酶生成并激活了血栓主要成分——纖維蛋白的形成。與血液接觸器械/材料相關的凝血主要通過接觸激活途徑發生，具體反應流程，見圖2。

圖2 凝血級聯反應

凝血產物隨著時間的推移具有不同的發展階段，不同階段的凝血產物水平可能會出現數量級差異，即當材料/器械與血液混合時，測試樣品的影響在每個階段可能是完全不同的。因此，評價時應在材料/器械與血液接觸的活化期進行。

通常采用ELISA試劑盒測定TAT（凝血酶—抗凝血酶復合物）、F1.2（凝血酶原形成凝血酶時釋放的蛋白質片段）和FPA（形成纖維蛋白時從纖維蛋白原釋放的蛋白質片段）、PTT（ASTM F2382）作為凝血指標（表2）。由于活化物質可掩蓋由器械或其材料組分引起的任何活化，因此活化部分凝血活酶時間（APTT）在體外評估血液接觸器械/材料的血栓形成時間中不推薦使用。此外，凝血酶原時間（PT）和凝血酶時間（TT）等指標通常也不推薦用于評估接觸血液的醫療器械和/或材料。

4.2.2 補體試驗

補體是由30余種廣泛存在于血清、組織液和細胞膜表面的蛋白質組成。醫療器械與機體相互作用時，補體激活不但可產生免疫毒性、超敏反應和過敏毒素，還可促進和加速醫療器械/材料表面的溶血、血小板、白細胞活化以至于形成血栓。補體激活途徑有3種：經典途徑、替代途徑和甘露糖結合凝集素途徑，其中替代途徑越過了C1、C4、C2三種補體成分，直接激活C3繼而完成C5至C9各成分的連鎖反應，是醫療器械最常引起的激活途徑。本版標準給出了補體激活替代途徑的原理圖（圖3）。

圖3 補體激活替代途徑的原理圖

某些補體成分的升高表明補體系統的激活，目前采用分子生物學方法（主要為ELISA法）檢測血液中補體激活的水平。試劑盒的靈敏度是選擇補體激活指標的關鍵因素，如雖然C5a片段被認為是與血液接觸器械相關的補體激活中最關鍵的補體因子之一，但試劑盒對該指標的靈敏度較低，故C5a不是常規的測試指標。經典的補體檢測為評估C3a和SC5b-9復合物，其中SC5b-9是補體激活后形成的末端通路產物，通常被認為是代表補體激活程度的較為重要的標記。CH50降低預示總體補體消耗，但CH50在醫療器械血液相互作用試驗中一般也不用于評估補體激活。由于補體激活試驗是體外試驗，方法敏感度較高，但由于不同試劑盒測試參數不同，影響因素較多，實驗室間數值差異較大（表2）。

補體激活通常在血液接觸器械材料表面后不久的早期階段發生。體外循環器械特別是與血液大面積接觸的器械，如血液透析器和心肺旁路系統等，補體激活是產生其不良反應的重要因素之一。由于補體激活嚴格依賴表面接觸，器械或材料的表面積對補體激活結果影響很大[5]，樣品制備時注意盡量不要選擇浸提液法，而是選擇直接接觸法，并盡可能提高器械或材料與血液接觸的表面積比例，以增加測試的反應靈敏度。但目前尚未得到與臨床不良事件相關聯的補體激活的器械與血液接觸的表面積閾值。

另外，作為有兩個相同來源的生物活性系統，凝血和補體之間相互作用存在一定的聯系，其結果有一定的相關性。

4.2.3 血小板

血小板與血栓形成有密切的關系，可通過粘附并釋放因子和/或聚集成止血栓子促進血栓形成過程。對與血液接觸的醫療器械和材料，ISO10993-4:2017推薦的常用指標為血小板計數和血小板脫顆粒（表2）。βTG、PF4是存儲在血小板α顆粒中并在血小板激活后大量釋放的蛋白質，TxB2是與物種無關的血小板激活標志物，是活化的血小板產生的有效的血小板激活劑。一般可采用細胞分類計數儀測定血小板計數，酶聯免疫吸附（ELISA）測定血小板脫顆粒。

血小板激活是一個動態過程，如果從試驗系統中取出試驗材料或器械后不能立即評價血小板，可添加檸檬酸—葡萄糖、檸檬酸鹽—茶堿—腺苷—雙嘧啶醇等血小板穩定劑阻止進一步的血小板活化并穩定血小板。另外，凝血級聯反應產生的凝血酶是一種有效的血小板激活劑，可以容易地引起血小板脫顆粒。因此，凝血和血小板激活之間存在一定的聯系。由于某些物質通過血小板活化而引起血栓形成，而其他物質通過凝血激活而產生血栓，因此有必要對兩者同時進行測試。

4.2.4 血液學

血液學評價包含血細胞和血漿成分定量測定（表2）。常用的血液學評價方法為全血細胞計數和白細胞激活。全血細胞計數主要測定血液中白細胞和紅細胞的數量或比例以及血小板計數，為器械/材料與血液成分相互作用提供基本信息。通過比較血小板和白細胞在與材料/器械接觸前后的計數可推斷激活的血小板和白細胞在血栓形成表面數量降低，為器械表面血栓形成提供依據。

4.3 溶血試驗

溶血試驗不參與血栓形成。一直以來，溶血被認為是一種重要的反映材料與血液相互作用的篩選試驗。根據醫療器械的特性和使用方式，引起溶血反應的主要原因有以下三種：滲透壓介導的溶血、機械介導的溶血、材料介導的溶血。特別要注意的是除了器械表面接觸（直接法）及材料提取物產生的溶血（浸提液法）外，一些器械（如血泵、機械心臟瓣膜、血液過濾器、單采和細胞分離系統等）在機械操作或在流經復雜管路時的流體力學、結構等因素產生的潛在的紅細胞變形等破壞作用[6-10]。故除了材料介導的溶血反應外，還應結合臨床使用條件，在臨床血液動力學條件下（血細胞比容、流速、壓力、接觸時間等）建立標準化的方法，評價此類型產品在機械力條件下可能產生的溶血潛能。這種標準化的方法應能預測在預期臨床使用過程的最差情況下（如最高血流速率等）產生的溶血。目前國際上推薦的標準化方法大多還未涉及到特定產品的方法。

國際上常見的材料介導的溶血試驗方法主要有下面幾種 ：ASTM F756-13[11]、MHLW 法[12]和 NIH 法[13]（ 由 于納米材料的特殊性能，常規試驗方法不一定適合納米材料，故由ASTM F756-13修改后采用的ASTM E2524-08[14]可用于納米材料的溶血測定）。ISO/TC194WG9工作組自2011年來，采用不同程度的溶血材料、不同浸提條件、不同種屬（人/兔）的血源、不同接觸方式（直接接觸/浸提液）發起了包含山東省醫療器械產品質量檢測中心在內的來自5個國家11個實驗室的Round Robin試驗。經過試驗驗證，三個試驗方法對材料溶血反應的敏感度不同，結果（如NIH法的直接接觸法）出現一定的差異[15]。SAC/TC248（醫療器械生物學評價技委會）在2016年起草并報批了行業標準《醫療器械溶血試驗 第1部分：材料介導的溶血試驗》，可作為我國企業和檢驗實驗室進行溶血試驗的方法學參考。

5 應注意的問題

5.1 標準化的試驗方法

除了溶血試驗外，ISO/TC194工作組近年來已經完成或正在推動的實驗室間血液相容性方法比對試驗還包括血栓形成體外替代試驗、補體激活試驗等，但由于器械與血液相互作用過程的復雜性，此次修訂的標準仍未列出具體的試驗方法。預計在不久的將來，ISO/TC194將制定出醫療器械適用的血液相互作用的試驗方法以TR（技術報告）的形式發布，供使用者根據器械臨床應用情況，選擇最適宜的試驗條件并盡可能地使用標準化的方法。

5.2 接觸表面積對測試結果的影響

測試器械與血液接觸時，凝血、血小板、補體等因素被激活的程度通常與血液接觸的器械表面積成比例[16]。由于器械或材料的表面積對測試結果影響很大，在測試時盡可能提高器械或材料的表面積與血液的接觸比例以增加測試的反應靈敏度。在每個研究中確認測試是很重要的。為充分評價材料的血液相容性的程度，可以設置表面積/血容量比（接觸比）為變量。按照GB/T16886.12《醫療器械生物學評價 第12部分：樣品制備與參照樣品》[16]，可以考慮3.0～6.0 cm2/mL血液（基于器械厚度）的接觸比至這個比值的1.5倍和2.0倍以增加血液成分對測試材料的敏感性。

5.3 應設立合理的對照物

由于一些臨床可接受的指標水平仍沒有確定的通過/失敗的閾值，故根據血液相容性試驗的特性，試驗時同時使用陽性對照、陰性對照或參考材料和已上市同類器械等參照物。值得注意的是，目前并沒有一類公認的陽性對照品或材料可在不同指標或試驗體系中獲得明顯的陽性結果，這就需要實驗室首先應確認陽性對照物以確保試驗體系的有效性和合理性。這樣，測量指標的臨床意義和由于獻血者遺傳學和實驗室方法等因素造成的結果變異性，可用統計學方法（如方差分析或均值比較）客觀地評估和解釋。

綜上所述，ISO 10993-4:2017在基于ISO 10993-1定義的預期用途和接觸時間對血液接觸類醫療器械進一步分類，對評價器械與血液相互作用的各種指標、相關的基本原理以及根據預期用途和血液接觸持續時間需要考慮的試驗選擇等內容進行了優化和補充。在醫療器械或材料基礎研究和早期開發領域，ISO 10993-4:2017標準的實施可以為確定醫療器械或材料及表面改性或新型醫療器械的血液相容性性能的試驗類型、適宜的方法提供進一步的參考指南。