星點設計-效應面法優化膏方煎煮工藝

朱 亮，王群星，王秀敏，顏 梅，徐菲拉#

(1.金華市中心醫院中藥房，浙江 金華 321000； 2.浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 310053)

膏方具有滋補、預防及治療疾病等作用，是針對人的體質、臨床表現而擬定的復方湯劑經反復煎煮濃縮后加入特定的輔料制成的半流質劑型，為中醫藥八大劑型之一[1]。出膏率是指按照規定的煎煮工藝生產，100單位質量的中藥材所產出的流浸膏或干浸膏的質量，與膏方的質量和成本關系密切，為中藥生產過程中的重要參數[2]。膏方的煎煮工藝對出膏率具有極大影響，容易造成中藥膏方質量的差異，直接影響其臨床療效[3]。優選中藥煎煮工藝的方法主要包括正交設計法、均勻設計法和星點設計-效應面優化法(central composite design，CCD)。CCD法可通過模型擬合描繪三維效應面，從較優區域直接讀取較優工藝條件，具有高精度、少試驗等特點[4-6]。因此，本研究通過引入CCD法，選取金華市中心醫院(以下簡稱“我院”)中藥膏方處方中不同入藥部位的常用藥材作為考察對象，以出膏率為評價指標，考察膏方煎煮工藝，優選較優條件，以期為CCD法應用于膏方煎煮工藝提供依據。

1 材料

1.1 儀器

98-1-B型電子調溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)；旋轉蒸發器RE-5203(上海亞榮生化儀器廠)；JZY-10型電動煎煮機、不銹鋼煎煮鍋(天津三延精密器械有限公司)；BT25S型電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；DZF6050型真空干燥箱(上海頓克儀器科技有限公司)。

1.2 藥品與試劑

制備膏方所需的藥材購于浙江中醫藥大學中藥飲片有限公司，均為《中華人民共和國藥典》(2015年版)收載品種。

2 方法與結果

2.1 處方擬定

取我院膏方制備常用藥材，按不同來源各稱取5 g，其中根及根莖類：首烏、牛膝、炒白術、炒白芍、甘草、黃芪、熟地、麥冬及山藥；皮類：瓜蔞皮、合歡皮、地骨皮、厚樸、杜仲、陳皮、黃柏及桑白皮；花類：玫瑰花、綠梅花、菊花、金銀花及款冬花；種子果實類：女貞子、菟絲子、柏子仁、酸棗仁、五味子、山茱萸及車前子；全草類：寄生、淫羊藿、白花蛇舌草、益母草、蒲公英、石斛及仙鶴草，混合備用。

2.2 出膏率測定方法

將總煎煮液通過預先稱定質量的微孔濾膜。過濾后，取出濾膜，并移置真空干燥箱中干燥至恒質量，濾膜所增加的質量即為不溶物質量(M4)。稱定濃縮液總質量(M1)，稱取濃縮液供試品(M2)約5 g，置于已稱定質量的蒸發皿，在水浴上干燥至浸膏，并移置真空干燥箱中干燥至恒質量，得供試品干質量(M3)，按公式(1)[出膏率(%)=(M1/M2)×(M3-M4)/處方投料量×100%]計算即得[7]。

2.3 單因素分析

2.3.1 冷浸時間考察：稱取膏方藥材5份，用10倍量水分別浸泡0.5、2、4、6及12 h，濾出水分，并測定濾出水分體積，計算吸水率，按公式(2){藥材吸水率(%)=[吸水后藥材質量(g)-吸水前藥材質量(g)]×100%/吸水前藥材重量(g)}計算即得[8]，測定各個時間段的吸水率分別為40.82%、78.57%、92.86%、102.97%及104.00%。結果表明，隨著冷浸時間的增加，吸水率隨之增長，在6 h后吸水率基本不再增長，結合膏方制作周期，故冷浸時間以6 h為考察對象。

2.3.2 煎煮次數考察：稱取膏方藥材5份，稱定，用10倍量水浸泡6 h，煎煮時間2 h，分別煎煮1、2、3、4及5次，測定出膏率分別為17.5%、32.1%、42.8%、43.8%及45.6%。結果表明，隨著煎煮次數增加，出膏率也增長，煎煮2次后，出膏率增長已較為平緩，故煎煮次數以2次左右為考察對象。

2.3.3 煎煮時間考察：稱取膏方藥5份，稱定，用10倍量水浸泡6 h，煎煮2次，煎煮時間分別為0.5、1、2、3及4 h，合并濾液，測定出膏率分別為19.0%、32.0%、44.3%、43.5%及43.4%。結果表明，煎煮2 h出膏率最高，且隨著煎煮時間的增加，出膏率變化不顯著，故選擇煎煮時間為2 h。

2.3.4 料液比考察：稱取膏方藥5份，稱定，分別加入水1 080、1 440、1 800、2 160及2 520 ml(即料液比為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12及1∶14)，浸泡6 h后煎煮2 h，各煎煮2次，合并濾液，測定出膏率分別為19.0%、32.2%、45.1%、44.3%及44.1%。結果表明，料液比為1∶10時出膏率達到峰值后無顯著性變化。

2.4 膏方藥材煎煮工藝優化

2.4.1 星點設計-效應面試驗設計與結果：以煎煮次數、煎煮時間和料液比為考察因素，但煎煮次數為非連續變量難于作回歸處理，因此結合預試驗結果和生產的實際，將煎煮次數固定為2次。選擇煎煮時間(X1)和料液比(X2)為考察因素，以浸膏得率為評價指標做二因素五水平的星點設計。根據星點設計原理，各因素設5個水平，用代碼-a、-1、0、+1、a來表示。對于二因素星點設計a=1.414[9]。設定X1范圍： 0.5～3.5 h；X2范圍：6～14倍。試驗因素水平、安排及結果分別見表1—2。

表1 星點設計試驗因素水平表Tab 1 Central composite design/response surface methodology level

表2 星點設計試驗安排及結果Tab 2 Arrangements and results of central composite design/response surface methodology

試驗模型通過最小二乘法擬合二次多項式方程可以表達為：Y=b0+b1Xl+b2X2+b3X1X2+b4X12+b5X22。其中Y為效應值(出膏率)，r為二項式模型方程擬合度系數，其顯著性由F值檢驗。

2.4.2 煎煮工藝優化結果分析：由design-expert 8.0得到星點設計的實驗結果，見表3；效應面法對浸膏得率分析結果見圖1—2。由圖1可知，取值較小時，效應面較陡，說明此時煎煮時間和料液比的改變對出膏率的影響較明顯。隨著因素取值增大，效應面趨向于平緩，提示此時煎煮時間和料液比的改變對出膏率的影響不顯著。

圖1 提取時間和料液比對出膏率影響等高線圖Fig 1 Contour map of effects of extraction time and material liquid ratio on paste ratio

2.4.3 模型擬合：模型擬合的目的就是用數學模型來近似擬合函數，當其接近到一定可信程度，就可以用于分析和優化操作。模型擬合的結果優劣可以用方差分析來進行判斷[10]。二項式擬合公式：Y=-63.84+26.51A+13.31B-5.41A2-0.56B2(r=0.917，P<0.01)。方差分析結果見表4。由表4可知，該模型擬合度較好，可用于預測試驗結果?；貧w模型系數顯著性結果表明：液料比、煎煮時間的平方對膏方得率的影響極顯著；料液比的平方及煎煮時間對膏方得率的影響顯著。結合較優模型結果，各因素對膏方得率影響的顯著性由大到小為液料比>煎煮時間。

圖2 提取時間和料液比對出膏率影響3D效應圖Fig 2 3D diagram of effects of extraction time and material liquid ratio on paste ratio

表3 膏方藥材煎煮工藝星點試驗設計與結果Tab 3 Design and results of water extraction by central composite design/response surface methodology

表4 二次回歸模型方差分析結果Tab 4 Quadratic regression model analysis of variance

注：**P<0.01，*P<0.05

2.4.4 效應面優化和驗證：根據自變量較優預測范圍，選取的工藝條件為11.8倍量水，煎煮2.4 h，根據所得的工藝條件進行3次驗證試驗，得到的出膏率平均為46.07%，RSD為1.43%。各考察指標與預測值相比較，偏差都較小，見表5；表明所建立的數學模型具有良好的預測性，本工藝為煎煮工藝條件所得的出膏率較穩定，驗證該工藝可行。

3 討論

膏方在中醫藥防治疾病中起著重要的作用[11]。隨著中醫“治未病”預防保健工作的開展和個體化膏方的興起，膏方業務在各大醫院和藥店迅猛發展[12]。但中藥膏方的煎煮工藝存在藥材浪費嚴重、工藝復雜及制備耗時長等問題，其粗放的制作工藝可能會直接影響臨床療效。相關文獻多采用正交試驗優選膏方煎煮工藝[13]，但該法采用線性數學模型，精度不高且無法精確找到最佳點，條件優選僅憑經驗，無法考察各因素間的相互作用等。星點設計則是采用非線性數學模型擬合，是集數學和統計學方法于一體的研究方法，通過模型擬合構建的三維效應面上直接讀取較優工藝條件，可在中心點進行重復實驗，具有提高實驗的精度、減少試驗等特點，已逐步應用于中藥提取分離工藝的優化試驗設計和分析[14-15]。

表5 膏方煎煮工藝驗證試驗結果Tab 5 Verification test results of paste decoction process

本研究通過引入星點設計-效應面法對煎煮工藝作精細篩選，以出膏率為評價指標，考察各因素在膏方煎煮過程中的變化趨勢，繪制效應面圖，實現工藝優選。本研究結果顯示，星點設計-效應面法對膏方煎煮工藝優化所得結果更加直觀，便于分析，提高了試驗精度。采用非線性模型擬合，各項系數的P均<0.05，復相關系數r=0.917 0，提示試驗所得的模擬方程是可信的，兩個因素對實驗結果的影響都是顯著，可對膏方煎煮工藝進行預測和分析。經驗證，預測值與真實值接近，其相對誤差為3.34%(n=3)，確定膏方煎煮工藝為用11.8倍量水煎煮2次，每次煎煮2.4 h，出膏率為46.07%(n=3，RSD=1.43%)，提示星點設計-效應面法優化膏方煎煮工藝準確可行，適宜作為篩選中藥煎煮工藝參數研究的試驗方法。

出膏率是評價膏方煎煮工藝的基本指標，將其控制在合理的范圍內具有一定的意義，但難以滿足膏方質量控制標準化[16]。因此，膏方研究將不斷深入，在規范膏方制備工藝的基礎上，既遵循傳統加工理念又引入現代科學技術，通過研究包括外觀、口感、流動性、黏度及水溶性等膏方成型性指標和指紋圖譜等分析手段，制定精確、全面且可控的綜合評價指標，以期構建科學合理化的膏方制備工藝與質量標準體系。