75%乙醇對黑曲霉菌的殺滅效果研究

石慶珊 彭永根 安洪偉

（國藥集團貴州血液制品有限公司，貴州黔東南556011）

0 引言

75%乙醇是較為常用的消毒液，試驗室通常用75%乙醇消毒桌面、臺面以及潔凈區房間，甚至用75%乙醇浸泡帶菌物品。按照2017年版消毒技術規范（2.1.1.9真菌殺滅試驗）規定，消毒劑對黑曲霉菌的殺滅對數值≥5.00。黑曲霉菌（Aspergillus niger）是一種常見真菌，早在2002年版消毒技術規范關于試驗指標菌的規定中，黑曲霉菌被定為致病性真菌的代表。鑒于黑曲霉菌培養的特殊性，一些研究者對其進行了檢測，并做了有關消毒劑對黑曲霉菌殺滅效果的評價，但對一定時間內消毒劑對黑曲霉菌的殺滅效果評價報道較少。

為了解75%乙醇消毒液在一定時間內對黑曲霉菌的消毒效果，本文對黑曲霉菌菌懸液進行了殺菌試驗[1]，以研究75%乙醇對黑曲霉菌的殺滅效果。

1 儀器與材料

1.1 儀器

電熱恒溫培養箱，寧波東南儀器有限公司；生物安全柜，蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.2 材料

沙氏葡萄糖瓊脂培養基，招遠拓普生物工程有限公司；黑曲霉菌[CMCC（F）98003]，招遠拓普生物工程有限公司；0.9%無菌氯化鈉溶液，貴州科倫藥業有限公司；吐溫-80，天津致遠化學試劑有限公司；75%乙醇，國藥集團貴州血液制品有限公司。

2 試驗方法

2.1 黑曲霉菌孢子懸液的制備

首先，取黑曲霉菌[CMCC（F）98003]凍干菌種管，用麥芽浸膏肉湯培養基進行增菌培養，再經過沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板劃線進行分離培養，選取單個典型菌落接種于沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養基上，在23℃條件下培養7天，得到新鮮培養物。然后，取5 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液洗下斜面上的孢子，將孢子洗脫。最后，采用無菌注射器吸出孢子懸液至無菌試管內，用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1 mL含黑曲霉菌孢子數100～200 CFU的孢子懸液備用。

2.2 中和劑的制備

取含20 g/L吐溫-80的胰蛋白胨大豆肉湯培養基（TSB）作為中和劑，能起到有效中和75%乙醇對試驗菌的殘留作用。

2.3 75%乙醇對黑曲霉菌的殺菌試驗

將75%乙醇分裝成0mL、2 mL、4 mL、6mL、8mL、10 mL的消毒液（陽性對照用0.9%無菌氯化鈉溶液），置于室溫下備用；取分別2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL的黑曲霉菌孢子懸液（黑曲霉菌孢子數100～200 CFU）于5支無菌試管中。然后，用不同體積的75%乙醇分別對5個不同體積的孢子懸液進行作用至預定時間，取0.5 mL菌藥混合液加入至4.5 mL的中和劑（含20 g/L吐溫-80的TSB）管內。中和作用10 min，取樣品液接種進行活菌計數培養，計算殺滅對數值。該試驗重復3次。

3 試驗結果

上述試驗重復做3次，試驗結果及分析分別如表1、表2、表3所示。

在表1中，0 mL的75%乙醇為菌懸液對照組。黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合后，每組數據顯示黑曲霉菌均已被大幅度殺滅。2 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合30 min后有1個黑曲霉菌菌落生長；4 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合35 min后有1個黑曲霉菌菌落生長；6 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合30 min后有2個黑曲霉菌菌落生長；8 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合20 min后有1個黑曲霉菌菌落生長，8 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合30 min后有1個黑曲霉菌菌落生長；10 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合30 min后有1個黑曲霉菌菌落生長，10 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合35 min后有1個黑曲霉菌菌落生長。上述5組試驗生長的菌落數均小于菌懸液對照組的2%，生長黑曲霉菌的時間點不是隨著時間的變化而變化，大部分的黑曲霉菌已經被殺滅，殘留極少的黑曲霉菌在混合液中分布不均勻。因此，在每個時間點都可能會生長黑曲霉菌。另外，35 min內黑曲霉菌沒有完全被殺滅，未被消毒液殺滅的菌落平均比值為0.183%。

在表2中，0 mL的75%乙醇為菌懸液對照組。黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合后，每組數據顯示黑曲霉菌均已被大幅度殺滅。4 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合35 min后有1個黑曲霉菌菌落生長；6 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合15 min后有1個黑曲霉菌菌落生長，6 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合20 min后有2個黑曲霉菌菌落生長，6 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合30 min后有2個黑曲霉菌菌落生長；8 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合30 min后有1個黑曲霉菌菌落生長；10 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合20 min后有1個黑曲霉菌菌落生長，10 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合25 min后有1個黑曲霉菌菌落生長，10 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合40 min后有1個黑曲霉菌菌落生長。上述5組試驗生長的菌落數均小于菌懸液對照組的2%，生長黑曲霉菌的時間點不是隨著時間的變化而變化，大部分黑曲霉菌已經被殺滅，殘留極少的黑曲霉菌在混合液中分布不均。因此，在每個時間點都可能生長黑曲霉菌。另外，40 min內黑曲霉菌沒有完全被殺滅，未被消毒液殺滅的菌落平均比值為0.283%。

表1 75%乙醇對黑曲霉菌殺菌試驗的結果分析（第1次）

表2 75%乙醇對黑曲霉菌殺菌試驗的結果分析（第2次）

在表3中，0 mL的75%乙醇為菌懸液對照組。黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合后，每組數據顯示黑曲霉菌均已被大幅度殺滅。2 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合30 min后有1個黑曲霉菌菌落生長；4 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合20 min后有1個黑曲霉菌菌落生長，4 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合25 min后1個有黑曲霉菌菌落生長，4 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合35 min后有1個黑曲霉菌菌落生長；6 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合25 min后有2個黑曲霉菌菌落生長；8 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合20 min后有1個黑曲霉菌菌落生長。上述5組試驗生長菌落數均小于菌懸液對照組的2%，生長黑曲霉菌的時間點不是隨著時間的變化而變化，大部分黑曲霉菌已經被殺滅，殘留極少的黑曲霉菌在混合液中分布不均。因此，在每個時間點都可能生長黑曲霉菌。另外，35min內黑曲霉菌沒有完全被殺滅，未被消毒液殺滅的菌落平均比值為0.192%。

表3 75%乙醇對黑曲霉菌殺菌試驗的結果分析（第3次）

通過對上述3次試驗結果分析，可得出每次黑曲霉菌未被75%乙醇殺滅的菌落平均比值，從而計算出每次已被75%乙醇殺滅的菌落平均比值，進而算出已被75%乙醇殺滅的菌落總平均值。綜合分析結果如表4所示。

通過重復3次的試驗數據統計，75%乙醇對菌懸液作用40 min內，未被75%乙醇殺滅的菌落總平均比值為0.219%。第1次試驗結果已被75%乙醇殺滅的菌落平均比值為99.817%，第2次試驗結果已被75%乙醇殺滅的菌落平均比值為99.717%，第3次試驗結果已被75%乙醇殺滅的菌落平均比值為99.808%，由此可得3次試驗已被75%乙醇殺滅的菌落總平均比值為99.781%。

4 試驗討論

本次研究重復3次試驗，3次試驗結果數據有一定差距，試驗全過程均在生物安全柜內進行，需要用的試管、吸管、平皿等器具均通過濕熱滅菌后方可使用，試驗前開啟紫外燈對生物安全柜滅菌消毒20 min，消毒完畢待風機運行30 min后進行試驗。3次試驗操作人員不變，操作時間、操作人員的動作幅度以及環境等因素，會對試驗結果產生一定影響。

5 結語

本研究結果顯示，75%乙醇消毒液對黑曲霉菌的殺滅能力很強。黑曲霉菌作為第四類病原微生物，通常情況下不會引發人類疾病，但會對藥品生產檢驗和環境構成威脅，75%乙醇消毒液能使黑曲霉菌的蛋白質凝固，使其不能形成薄膜，通過酒精持續向其內部滲透并進行消毒殺菌，本試驗殺滅效果可達到99.781%。

表4 75%乙醇對黑曲霉菌重復3次殺菌試驗結果的綜合分析