黑豆皮花色苷酯化修飾及其降解與抗氧化特性

蔣新龍 蔣益花

(浙江樹人大學生物與環境工程學院，杭州 310015)

黑豆皮富含花色苷類色素，其主要成分是飛燕草素－3－葡萄糖苷和矢車菊素－3－葡萄糖苷［1］?；ㄉ帐?－苯基－苯并吡喃陽離子結構的衍生物，屬于植物多酚中類黃酮類化合物［2］，有很強的抗氧化活性，具有預防心血管類疾病、糖尿病和抗腫瘤等醫療價值［3－4］。但花色苷親脂性較差，其穩定性還受到pH、存儲溫度、光照、氧氣、金屬離子等諸多因素的影響［5－7］，從而限制了其使用范圍。本實驗以黑豆皮花色苷為研究對象，以酯化率為衡量指標，用丁二酸酐對黑豆皮花色苷進行酯化修飾，并對其光熱降解作動力學分析和抗氧化穩定性分析，為提高黑豆皮色素的穩定性提供新途徑，為進一步開發利用黑豆皮花色苷提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試黑豆品種為“黑豆1號”，種皮由安徽黑糧農業種植推廣專業合作社提供。取其種皮，烘干，過60目篩，備用。所用試劑為分析純，所用水為蒸餾水。

BRUKER TENSOR 27傅里葉紅外光譜儀;UV－9100紫外可見光譜儀;UV－2450PC紫外可見分光光度計;pHS－3B型精密pH計;RE－52旋轉蒸發儀。

1.2 方法

1.2.1 黑豆皮花色苷的制備

根據文獻［8］方法制備，得粉末狀深黑色黑豆皮花色苷(black soybean anthocyanin，簡稱BSA，下同)。

1.2.2 酯化修飾花色苷的制備

1.2.2.1 酯化修飾工藝路線［9］

根據孫華玲等［9］制備方法并稍做改動:黑豆皮色素→無水乙醇溶解→調節一定pH值→加入丁二酸酐→水浴加熱→除去乙醇和過量丁二酸酐→洗滌干燥→黑豆皮色素酯化產物(esterification modification of black soybean anthocyanin，簡稱 MBSA，下同)。

1.2.2.2 酯化修飾工藝優化

為使修飾反應盡可能獲得最大收率，因此以酯化率(E)作為修飾色素的評價指標。酯化率參照文獻［6］中的方法測定，按照式(1)進行計算。

式中:E為酯化率/%;Cl為修飾后色素的色價;ml為修飾后色素質量/g;C為原色素的色價;m為原色素質量/g。

在使用正交優化之前，應先進行單因素實驗，確立合理實驗的各因素和水平。

單因素平行實驗:稱取0.100 g黑豆皮色素，按照1.2.2.1方法對酯化修飾過程中的無水乙醇:色素的液料比、pH、酯化溫度、時間、丁二酸酐:色素的配比五因素分別進行水平篩選及優化。設置丁二酸酐與黑豆皮花色苷的配比6 g·g－1，pH 為 3.0±0.1，60 ℃，3 h，考察乙醇與色素液料比(10、20、30、40、50、60 mL·g－1)對酯化率的影響;設置乙醇與黑豆皮花色苷的液料比30 mL·g－1，丁二酸酐與黑豆皮花色苷的配比 6 g·g－1，60 ℃，3 h，考察 pH(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)對酯化率的影響;設置乙醇與黑豆皮花色苷的液料比30 mL·g－1，丁二酸酐與黑豆皮花色苷的配比 6 g·g－1，pH 為 3.0±0.1，3 h，考察酯化溫度(40、50、60、70、80 ℃)對酯化率的影響;設置乙醇與黑豆皮花色苷的液料比30 mL·g－1，丁二酸酐與黑豆皮花色苷的配比 6 g·g－1，pH 為3.0 ±0.1，60 ℃，考察反應時間(2、3、4、5、6、7 h)對酯化率的影響;設置乙醇與黑豆皮花色苷的液料比30 mL·g－1，pH 為3.0 ±0.1，60 ℃，4 h，考察丁二酸酐與色素配比(2、4、6、8、l0、12 g·g－1)對酯化率的影響。

正交實驗:根據無水乙醇與黑豆皮花色苷的液料比、丁二酸酐與黑豆皮花色苷的配比、反應pH值、反應溫度、反應時間5個單因素實驗結果，確定丁二酸酐與色素配比、反應溫度、反應時間3個關鍵因素進行三因素三水平正交實驗。酯化修飾工藝的最終衡量標準是酯化率，以酯化率最大時的條件為最優酯化修飾條件。

1.2.3 紅外光譜分析

德國布魯克BRUKER TENSOR 27傅里葉紅外光譜儀。參數設置:DTGS－KBr檢測器;分辨率4 cm－1，掃描60 次，光譜采集范圍為 4 000 cm－1～1 000 cm－1。分別取花色苷色素與酯化修飾色素粉末少量，與KBr混合，研磨均勻后壓片，放入紅外光譜儀中測定，比較酯化前后的結構變化。

1.2.4 花色苷降解實驗

將酯化前后花色苷溶于75%乙醇，用pH=3.0的檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖溶液稀釋至吸光度0.2 ～0.8，進行花色苷降解實驗。

熱降解實驗:將所制備的酯化修飾花色苷溶液，分別置于50、60、70、80、90 ℃恒溫水浴10 h，每隔2 h測定吸光度值，以未酯化修飾花色苷溶液作空白對照，重復3次。

光降解實驗:將所制備的酯化修飾花色苷溶液，分別置于24℃恒溫室內自然光(平均光強4 000 lx)、強日光(平均光強85 000 lx)和避光條件下進行對照試驗，每隔2 d測定吸光度值，以未酯化修飾花色苷溶液作空白對照，重復3次。

1.2.5 熱降解動力學參數分析

假設酯化前后花色苷的熱降解反應與許多學者研究結果相符［10］，符合一級反應動力學，則可根據下式計算熱降解反應速率常數(k)、熱降解活化能(E0)、熱降解半衰期(t1/2)等參數。

k、E0由 Arrhenius方程確定［8，10］:

式中:t為反應時間;c0為色素加熱前的最初濃度;c為色素加熱后的終濃度;k0為頻率常數;E0為活化能/kJ· mol－1;R 為氣體常數 (8.314 × 10－3kJ·mol－1·K－1);T 為絕對溫度/K。

根據朗伯比爾定律，濃度C與溶液的吸光值A成正比，故式(1)可表示為ln(A/A0)=－kt。熱降解半衰期 t1/2=0.693/k。

1.2.6 光降解動力學參數分析

方法同1.2.4。計算降解反應速率常數(k)和降解半衰期(t1/2)。

1.2.7 抗氧化能力實驗

DPPH·法是用以評價天然抗氧化劑抗氧化活性的一種快速、簡便、靈敏可行的方法［11］。以DPPH·清除活性作為抗氧化活性檢測指標。根據文獻［11］方法并加以改進來測定計算對DPPH·的清除率Y:用無水乙醇配制2×10－4mol/L的DPPH·溶液。在10 mL具塞試管中加入2 mL DPPH·溶液(2×10－4mol/L)和2 mL一定濃度的色素溶液，總體積4 mL?；旌暇鶆?，黑暗下室溫避光反應30 min后，以無水乙醇調零點，于光徑1 cm比色皿中測定DPPH·混合溶液在517 nm處的吸光度。

式中:Ai為2 mL DPPH·溶液+2 mL色素溶液的吸光度;Aj為2 mL色素溶液+2 mL無水乙醇的吸光度;Ac為2 mL DPPH·溶液+2 mL無水乙醇的吸光度。

分別測定花色苷處理前后對DPPH·的清除率Y%，再按式(4)計算對DPPH·的清除率Y的保存率(%):

式中:Y為處理后對DPPH·的清除率/%;Y0為處理前對DPPH·的清除率/%。

將所制備的酯化花色苷溶液，置于自然光中放置10 d，每隔2 d取樣測定1次，計算對DPPH·的清除率及其保存率，并以未酯化花色苷溶液作空白對照，比較其抗氧化能力。

1.3 統計方法及分析軟件

指標均重復測定3次并取平均值，利用Origin8軟件作圖;應用SPSS20.0軟件進行數據統計，并用Duncan多重比較(SSR法)檢驗各處理平均數之間的差異顯著性(P ＜0.05)。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇與色素液料比對酯化率的影響

由圖1可看出，在一定的液料比范圍內，酯化率隨液料比的增加而增大，當液料比達到30 mL·g－1時，酯化率達到最大值。在一定反應條件下，當丁二酸酐與黑豆皮花色苷用量固定時，隨著液料比的增加，有利于反應物接觸，提高反應效率。如液料比進一步增加，丁二酸酐和黑豆皮花色苷濃度隨之減少，酯化反應速率也隨之減少。當液料比達到30 mL·g－1時，酯化率與其他幾個水平差異顯著(P＜0.05)，所以后續實驗黑豆皮色素與乙醇的液料比選擇30 mL·g－1。

2.1.2 pH 對酯化率的影響

由圖1可看出，pH值對黑豆皮花色素的影響較大，pH 3.0時酯化率最大，且與其他幾個水平差異顯著(P＜0.05)。隨著pH的增加，酯化率也隨之增加，當pH超過3.0時，酯化率逐漸減少，這與其他學者研究結果不同［9］。決定pH的關鍵因素主要是花色苷的穩定性和丁二酸酐水解反應的快慢。本研究調節pH時本身含水，丁二酸酐的水解反應不是限制條件，最主要考慮的是花色苷的穩定性，因為黑豆皮花色苷水解平衡點約為pH 3.5［8］。所以后續選擇pH 3.0的95%乙醇進行實驗。

2.1.3 酯化溫度對酯化率的影響

圖1可知，低于60℃時，升溫可提高花色苷在溶劑中的溶解度和擴散系數，從而加速酯化反應;繼續升溫，花色苷在高溫的酸性溶液中容易降解，含量反而會降低。本實驗所選酯化溫度的3個水平為50、60、70 ℃。

2.1.4 反應時間對酯化率的影響

由圖1可看出，2～4 h內隨著時間的增加酯化率增大較明顯;超過4 h，酯化率提高差異不明顯?？紤]能源成本，本實驗所選反應時間的3個水平為3、4、5 h。

2.1.5 丁二酸酐與色素配比對酯化率的影響

由圖1可知，丁二酸酐與黑豆皮花色苷的配比小于6 g·g－1時，隨著丁二酸酐與黑豆皮花色苷的配比的增加，酯化率也隨著增加，但是當比例超過6 g·g－1時，酯化率逐漸減少。故反應體系中不宜添加太多的丁二酸酐，本實驗所選丁二酸酐與黑豆皮花色苷配比3 個水平為4、6、8 g·g－1。

圖1 酯化修飾黑豆皮花色苷單因素實驗結果

2.2 正交優化實驗

根據單因素實驗，確定液料比30 mL·g－1、pH 3.0為固定值，以丁二酸酐與色素配比、反應溫度、反應時間3個關鍵因素進行3因子3水平正交實驗，結果見表1。由表1極差R分析，可判定影響酯化率的因素主次依次排列為:反應溫度(A)＞丁二酸酐與色素配比(C)＞反應時間(B)，由表2方差分析可知，反應溫度對酯化率的影響顯著，其他對酯化率的影響則都不顯著。直觀分析，實驗的最優水平組合為A2B2C3;根據每個因素K1、K2、K3，實驗的最優水平組合為A2B2C2。Duncan法分析結果，反應溫度50、60、70℃相互之間都有顯著差異;反應溫度50℃與60、70℃之間有顯著差異，但60℃與70℃之間無顯著差異;反應時間3 h與4、5 h相互之間有顯著差異，但4 h與5 h之間無顯著差異;丁二酸酐與色素配比 4 g·g－1與 6、8 g·g－1之間有顯著差異，但6 g·g－1與8 g·g－1之間無顯著差異。綜合考慮制備成本，確定最佳工藝條件為A2B2C2，即反應溫度60℃，反應時間4 h，丁二酸酐與色素配比6 g·g－1。根據預測最優條件進行驗證實驗，所得酯化率的平均值為46.70%，實驗結果與預測值無顯著差異。

表1 正交實驗結果

表2 方差分析表

2.3 紅外結構表征

圖2為黑豆皮色素和酯化產物的紅外光譜圖。二者紅外分析圖具有相似的輪廓。對比酯化前后的花色苷譜圖，不難發現，譜圖最大的差異在1 716 cm－1(酯羰基CO的伸縮振動峰)和1 201 cm－1(C—O—C的基團的伸縮振動峰)，其他官能團的特征吸收峰并沒有明顯的變化。一般來說，判斷酯基存在的主要特征吸收就是CO和C—O—C的伸縮振動峰［12］，因此，可以判定花色苷經過酯化修飾后，分子中含有大量的酯基，酯化反應只是在原來的花色苷分子上增加了新的酯基團。

圖2 黑豆皮色素和酯化產物的紅外圖譜

2.4 花色苷降解動力學參數分析

2.4.1 花色苷熱降解動力學參數分析

根據1.2.5方法，圖3為酯化修飾前后 pH 3.0時花色苷色素液熱穩定性A～t的對應實驗數據。圖3顯示，隨著溫度升高，花色苷的熱穩定性都降低，說明花色苷對熱表現出不穩定的特性，與許多學者研究結果相吻合［13］。

根據－Ln(A/A0)－t進行線性回歸，表3結果表明線性關系良好(相關系數R＞0.98)，酯化修飾前后花色苷熱降解均符合動力學一級反應規律，與許多學者研究結果相符［14］。在相同條件下，酯化修飾花色苷的降解反應速率都比未酯化修飾的要低，且兩者有顯著差異(P＜0.05)。說明丁二酸酐酯化修飾能提高黑豆皮花色苷的穩定性。

反應活化能是決定反應速率的重要因素，在一定溫度下，活化能越大，反應越慢。根據Arrhenius方程，用花色苷降解的lnk對1/T進行線性回歸，可得到復相關系數R(R＞0.98)和活化能。表3顯示，在一定溫度下，以活化能計，MBSA＞BSA，說明酯化修飾花色苷的熱穩定性較好，有利于色素在熱處理條件下的應用及保存。

圖3 加熱時間對花色苷降解的影響

半衰期是衡量花色苷熱穩定性的一個重要參數，即花色苷降解50%所需的時間。從半衰期來看，花色苷溶液隨溫度升高，花色苷的熱穩定性都降低。在較低溫度50、60℃時，酯化修飾前后的花色苷熱降解的半衰期有極顯著差異(P＜0.01)，但在90℃條件下差異不顯著。這是由于黑豆皮花色苷色素受熱后，其結構向查耳酮轉變，導致生色結構2－苯并吡喃鹽和醌式假堿減少。所以加工利用過程中可以根據實際需要選擇適宜的處理條件，避免長時間、高溫加熱，以防止花色苷的降解。

表3 花色苷熱降解動力學及降解參數

2.4.2 花色苷光降解動力學參數分析

圖4顯示，酯化修飾前后花色苷的光穩定性不同。相同條件下，MBSA－暗處＞BSA－暗處＞MBSA－自然光＞BSA－自然光＞MBSA－強光＞BSA－強光。光照強度越高，時間越長，花色苷降解程度越高。酯化修飾花色苷的光穩定性優于未酯化修飾花色苷。

不同花色苷色素液光穩定性根據－ln(A/A0)－t作圖并進行線性回歸，表4表明線性關系良好(R＞0.98)，花色苷光降解符合動力學一級反應規律，與許多學者研究結果相符［14］。表4也顯示，光照強度小的穩定性好，表現為降解速率小、半衰期長。在強日光條件下，酯化修飾前后的花色苷半衰期差異不顯著(P＞0.05)但在自然光和避光條件下差異顯著(P＜0.05)。酯化修飾處理后能提高花色苷光穩定性，有利于色素的應用及保存。

2.5 抗氧化能力測定

圖5顯示，酯化修飾后較酯化修飾前對DPPH·清除率略有降低。隨著保存時間的延長，二者對DPPH的清除率均下降且下降趨勢相似，但酯化花色苷清除率下降速度略低于未酯化花色苷。因此，酯化修飾處理后能提高花色苷抗氧化穩定性。

圖4 光照時間對花色苷降解的影響

圖5 時間對DPPH·清除率及其保存率的影響

表4 不同花色苷光降解動力學及參數

3 討論

黑豆皮花色苷主要成分是飛燕草素－3－葡萄糖苷和矢車菊素－3－葡萄糖苷，含多個酚羥基，親脂性較差。本研究以黑豆皮花色苷為原料，丁二酸酐為?；瘎?，在花色苷的酚羥基上引入?；M行酯化修飾。研究表明:無水乙醇:色素30 mL·g－1溶解黑豆皮花色苷，在pH 3.0的介質中，丁二酸酐:色素6 g·g－1，酯化溫度60℃，時間4 h，完成酯化修飾過程，所得酯化率為46.70%。紅外圖譜表明，用丁二酸酐對黑豆皮花色苷進行酯化修飾的花色苷并未破壞原色素的基本結構，只是在原來的花色苷分子上增加了新的酯基團。

本研究的熱降解實驗結果表明，在同一條件下，酯化修飾前后花色苷的降解反應速率、活化能、半衰期等參數有明顯差異，丁二酸酐酯化修飾能提高黑豆皮花色苷的穩定性，與許多學者研究結果相符［15－16］。Yoshida 等［17］認為，?；ㄉ帐窃诜肿觾刃纬闪恕叭髦?sandwich)”結構。?；ㄉ盏挠袡C酸與糖鏈相連，這些糖鏈像一條帶子將有機酸置于 2 － 苯基苯并吡喃骨架的表面［18］，Dougall［19］認為，?；螽a生的這種結構會阻礙花色苷分子的轉化，從而提高其穩定性。酯化產物的熱穩定性好，主要由于酯基團的包裹作用提高了色素的熱穩定性［20］。

本研究的光降解實驗結果同樣表明，酯化修飾處理后能提高花色苷光穩定性，表現為降解速率小、半衰期長，有利于色素的應用及保存。這還是和酯化花色苷“三明治”結構和形成有機酸－糖鏈堆積于2－苯基苯并吡喃骨架表面的作用有關［18］?；鶓B的花色苷吸收光能后轉變為激發態的花色苷，激發態的花色苷再發生水解等降解反應［21］。Attoe等［22］認為，光誘導花色苷降解主要是存在分子態氧的原因。酯化修飾處理盡管能通過有機酸－糖鏈堆積于2－苯基苯并吡喃骨架表面形成“三明治”結構，但阻擋不了分子態氧的作用。因此，不管是否酯化修飾處理，花色苷在食品中應用時，都應采用真空包裝以提高產品穩定性。

本研究的抗氧化實驗結果表明，對DPPH·清除率而言，酯化修飾后略有降低，這是因為丁二酸酐修飾使苯環上羥基數量減少，與張媛媛等［23］研究結果相符，但酯化修飾處理后能提高花色苷抗氧化穩定性，這還是由于酯化花色苷“三明治”結構的形成有關［18］。

4 結論

采用正交優化丁二酸酐酯化修飾黑豆皮花色苷工藝并測定其抗氧化活性。在單因素實驗的基礎上，運用響應面設計的理論與方法，確定了最佳酯化工藝:無水乙醇:色素30 mL·g－1，丁二酸酐:色素6 g·g－1，pH 3.0，酯化溫度 60 ℃，時間 4 h。在此條件下，黑豆皮花色苷酯化率為為46.70%。

丁二酸酐酯化修飾黑豆皮花色苷的光熱降解動力學都符合動力學一級反應規律，且線性關系良好(R＞0.98)。以活化能計，MBSA＞BSA。從半衰期來看，在較低溫度50、60℃時，酯化修飾前后的花色苷熱降解的半衰期有極顯著差異(P＜0.01)。添加丁二酸酐對黑豆皮花色苷在90℃條件下酯化修飾不顯著。在自然光和避光條件下，酯化修飾前后的花色苷半衰期差異顯著(P＜0.05)，但在強日光條件下差異不顯著(P＞0.05)。酯化修飾處理后能提高花色苷光熱穩定性，有利于色素在光熱處理條件下的應用及保存。酯化修飾處理后，黑豆皮花色苷清除DPPH·自由基能力略降低，但能提高花色苷抗氧化穩定性。