滋脾通絡顆粒對2型糖尿病大鼠早期腎病的保護作用

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1.海南省藥物研究所，海南 ?？?570311；2.海南省中醫院，海南 ?？?570216

糖尿病腎病作為一種由糖尿病引發的并發癥，在發達國家占到了所有腎功能衰竭病例中的30%～40%[1]，由于2型糖尿病的人數增加，2型糖尿病腎病的發生數也逐年上升，其中20歲以上的糖尿病患病率高達9.7%，2013在我國糖尿病人數為9840萬，居全球首位[2]。因此防控2型糖尿病腎病的形勢可謂十分嚴峻?！白唐⑼ńj湯”在海南省中醫院長期作為院內制劑使用，為控制2型糖尿病早期腎病藥物，療效在臨床已得到證實[3]，實驗驗證經過干燥制粒后的“滋脾通絡顆?！笔欠袢杂兴幬锕π?，同時通過對大鼠2型糖尿病腎病模型的效果更直觀的考察藥物對大鼠腎臟的作用情況。

1 實驗材料

1.1 受試藥物 滋脾通絡顆粒(8 g/袋，由黃芪、當歸、赤芍、山藥、牛膝、大黃、鬼箭羽、三七、水蛭、甘草水提液加輔料干燥制成，批號：20170801，海南省中醫院提)；鹽酸二甲雙胍緩釋片(批號：170807，山東司邦得制藥有限公司)。

1.2 動物 SPF級SD大鼠，雄性，55只，體重(180±20)g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，生產許可證號：SCXK(湘)2014-0011，動物飼養于海南省藥物研究所SPF動物房，使用許可證號：SYXK(瓊)2014-0025。

1.3 儀器 大鼠代謝籠，Accu-Chek Performa血糖儀(羅氏)，ST-360酶標儀(KHB)，WD-2103A洗板機，Eclipse 50i顯微鏡(Nikon )，7100 Automatic Analyzer血生化儀(Hitachi )，病理切片設備(Leica RM2235，EG1150H，EG1150C，HI1210/1220，TP1020)。

1.4 材料 ELISA試劑盒(批號：170711，上海恒遠)，血生化試劑(Wako DF769，DG501)。

2 方法

2.1 模型動物的制備及分組 根據適用癥模型，選擇大鼠2型糖尿病模型進行造模，造模方式為鏈脲佐菌素(STZ)輔以高脂飼料喂養[4]。SD大鼠先以高脂飼料喂養21 d，禁食不禁水12 h，稱量大鼠體重，并按照體重將STZ以25 mg/kg小劑量腹腔注射(i.p.)。注射完成后正常飲水，并繼續給予高脂飼料喂養。于14 d測量空腹血糖(禁食8 h)，選取血糖濃度高于15 mol/L的大鼠。繼續喂養14 d，收集24 h全尿液，尿白蛋白含量高于5 mg/d的大鼠可認為發生早期腎病[5]。

將2型糖尿病早期腎病成模大鼠50只隨機分為5組，每組10只。分別為滋脾通絡給藥高、中、低劑量組，二甲雙胍組，模型組。

2.2 給藥及劑量 根據長期毒性試驗劑量確定本次藥效學研究劑量為7.5 g/kg，給藥中劑量組及低劑量組分別為高劑量組劑量的1/2及1/4，即3.75 g/kg及1.88 g/kg(以成品計算)。高中低3個劑量組設置分別為60 kg人用劑量的9.37、4.69及2.34倍；若按照體表面積折算，則是相對大鼠等效劑量的1.52、0.76及0.38倍[3]。陽性藥鹽酸二甲雙胍緩釋片依據人用劑量平均1 g/d·60 kg折合為大鼠等效劑量約為1.0 g/kg(0.5 g×2片/60 kg×6.17系數≈1.0 g/kg)，按照大鼠日均飲水量磨碎后放入飲水中稀釋，由大鼠自由飲取，每日更換新配藥物飲水。模型組給予等體積生理鹽水，滋脾通絡3個劑量組均按照15 mL/kg體積灌胃給藥。

2.3 觀察指標 每周測量一次大鼠體重及空腹血糖(FBG)，比較各組大鼠差異。連續灌胃給藥6周后，收集大鼠24 h尿液測尿白蛋白(UAER)；尿肌酐(Ucr)含量，麻醉大鼠腹主動脈取血測血清肌酐(Scr)，血清尿素氮(BUN)，利用公式求校正的內生肌酐清除率，公式如下：

內生肌酐清除率=(尿肌酐濃度×每分鐘尿量)/血清肌酐濃度得到的結果除以大鼠體重即為每kg體重的肌酐清除率(Ccr)。

采集血清后，取大鼠雙側腎臟，10%甲醛溶液(福爾馬林)固定，切片，HE染色法染色，觀察光鏡下的腎小球，腎小管病變情況。

2.4 統計方法 采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，方差齊以Dunnett-t檢驗各組與對照組之間的差異水平，方差不齊以Dunnett-T3檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 對大鼠體重的影響 除二甲雙胍組體重仍有增加外，其余各組體重均不同程度減輕。在第6周之后，滋脾通絡顆粒給藥高劑量組與模型組相比，體重增加差異具有統計學意義(P<0.05)。滋脾通絡中劑量和低劑量相比模型組則差異無統計學意義(P>0.05)。陽性藥鹽酸二甲雙胍對照組大鼠體重則在整個實驗期間與模型組相比均有顯著增加，差異有顯著統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 滋脾通絡顆粒對大鼠體重的影響 ±s)

注：與模型組比較，*P<0.05、**P<0.01。

3.2 對大鼠FBG的影響 滋脾通絡高、中劑量組分別在給藥第3周、第4周FBG明顯降低，和模型組同期FBG相比，差異具有統計學意義(P<0.05)，至第6周與同期模型組大鼠相比，FBG值降低具有顯著統計學意義(P<0.01)。滋脾通絡顆粒低劑量給藥組試驗全程未見與模型組FBG的統計學差異。見表2。

表2 滋脾通絡顆粒對大鼠FBG的影響 ±s)

注：與模型組比較，*P<0.05、**P<0.01。

3.3 對大鼠Scr、BUN、UAER、Ccr的影響 滋脾通絡高劑量給藥組無論Scr、BUN、UAER均較模型組低，且差異具有顯著統計學意義(P<0.01)，滋脾通絡顆粒中劑量給藥組Scr及UAER亦均較模型組低，差異具有統計學意義(P<0.05)，BUN與模型組相比差異有顯著統計學意義(P<0.01)。低劑量組與模型組相比差異均無統計學意義(P﹥0.05)。滋脾通絡顆粒高劑量組能夠顯著降低Ccr(P<0.05)，其余各組與模型組相同。見表3。

表3 對大鼠Scr、BUN、UAER、Ccr的影響 ±s)

注：與模型組比較，*P<0.05、**P<0.01。

3.4 對大鼠腎切片外觀的影響 由HE染色的腎小球切片可以看到，模型組大鼠腎小管上皮細胞明顯擴張，胞漿疏松，出現水腫；腎小球體積明顯增大，基底膜增厚，腎小球囊擠壓消失。滋脾通絡顆粒低劑量組與模型組表現相似，均出現明顯DN特征。滋脾通絡給藥高劑量組與陽性藥物鹽酸二甲雙胍緩釋片組大鼠腎小球體積，腎小管上皮細胞較模型組均有明顯緩解。滋脾通絡中劑量組也有緩解DN癥狀特點。見圖1。

4 討論

本實驗結果表明滋脾通絡顆粒能夠明顯緩解糖尿病大鼠腎小球肥大等早期DN的主要病理改變，通過實驗可見滋脾通絡顆粒能夠穩定空腹血糖在一個相對較低的水平，起到緩解腎臟負擔，控制早期DN繼續發展的趨勢。經滋脾通絡顆粒治療的大鼠無論尿量還是每日的尿白蛋白含量均低于模型組DN大鼠，Scr及BUN含量也較DN模型組大鼠更低。經大鼠體重校正后的Ccr結果表明，與人類腎病發生后Ccr較正常值降低相反，腎病大鼠Ccr升高，這也與許多文獻中報道的一致[7-9]，但具體是何原因導致大鼠Ccr與人類Ccr表象相反仍不清楚其中機理。經治療后的大鼠Ccr較模型組低，滋脾通絡高劑量組能顯著降低Ccr水平。

處方中黃芪味甘性溫為補氣要藥，取其大補脾胃之元氣，使氣旺以助血行；山藥甘平，歸脾肺腎經,既補三臟之氣，又滋其陰，二藥相合，氣血雙補，相配為君。當歸、赤芍、川牛膝活血而不傷正，補血而不滯血。其中黃芪、山藥、牛膝、大黃、水蛭成分可能具有抑制系膜細胞凋亡的作用[10]，黃芪、當歸、赤芍、山藥、牛膝、大黃、水蛭、甘草等的配伍具有益氣活血利水作用，能夠消退水腫，減少蛋白尿，延緩腎功能衰竭的速度[11]。鬼箭羽具有降低全血粘度，降低血糖，雙向調節脂質代謝的作用[12]。綜上，本處方藥物在降糖，消水腫，降低蛋白尿等多方面作用于糖尿病早期腎病，具有綜合的延緩糖尿病早期腎病病程作用。