游離亞硝酸抑制硝化桿菌屬(Nitrobacter)活性動力學研究

孫洪偉,于 雪,李維維,祁國平,馬 娟,陳永志,呂心濤

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游離亞硝酸抑制硝化桿菌屬()活性動力學研究

孫洪偉1,2*,于 雪1,2,李維維3,祁國平3,馬 娟1,2,陳永志1,2,呂心濤4

(1.蘭州交通大學環境與市政工程學院,甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省污水處理行業技術中心,甘肅 蘭州 730070；3.甘肅省輕工研究院,甘肅 蘭州 730070；4.北京城市排水集團有限責任公司科技研發中心,北京 100032)

為探究游離亞硝酸(FNA)對亞硝酸鹽氧化細菌中硝化桿菌屬()活性抑制動力學影響,采用序批式活性污泥(SBR)反應器,在通過改變系統進水FNA濃度達到富集基礎上,以富含污泥為對象(宏基因組物種注釋和豐度分析顯示上占細菌總數40.3%),基于批次試驗,考察不同FNA濃度梯度下亞硝酸鹽氧化過程比亞硝態氮氧化速率(SNiOR)變化規律,進而擬合FNA抑制活性抑制動力學模型,并進行統計學分析.結果表明,當FNA≤0.1mg/L時,隨著FNA濃度升高,SNiOR迅速升高.當FNA＞0.1mg/L時,SNiOR隨著FNA濃度升高而降低.尤其當FNA濃度高于0.7mg/L時,SNiOR始終維持在0gN/(gVSS·d),表明活性統被完全抑制.統計學分析結果顯示相對于Haldane、Aiba、Edwards-1#、Edwards-2#、Luong抑制動力學模型,Han-Levenspiel模型最適合描述FNA對活性的抑制影響.其統計學常數:殘差平方和(RSS)為0.02、可決系數(2)為0.90、擬合方程的方差檢驗統計量值為78.1、可信度值為3.29×10-12,其動力學常數值分別為:最大比亞硝態氮氧化速率(max)為1.57gN/(gVSS·d);半飽和常數(S)為0.01mg/L;臨界抑制常數(m)為0.66mg/L.

游離亞硝酸；硝化桿菌；比亞硝態氮氧化速率；抑制動力學；宏基因組

在廢水生物脫氮系統中,氨氧化菌(AOB)和亞硝酸鹽氧化菌(NOB)以協同作用共存,完成氨氮(NH4+-N)向硝態氮(NO3--N)轉化,AOB將NH4+-N氧化為亞硝態氮(NO2--N),NOB將NO2--N進一步氧化為NO3--N.NOB主要是由4類菌屬構成:硝化桿菌屬(),硝化球菌屬(),硝化刺菌屬()和硝化螺菌門()[1].研究表明,和是污水處理系統中最為常見NOB菌屬[2],其中在高底物濃度、高溶解氧條件下含量遠高于[3-4].大多研究者認為,硝化反應過程中游離氨(FA)和亞硝酸根(NO2-)的質子化產物游離亞硝酸(FNA)對NOB存在一定的抑制作用[5-6].Anthonisen等[7]研究認為FNA是抑制NOB活性的主要因素之一,一定濃度的FNA對NOB活性具有強烈的抑制作用.Ma等[8]對富含NaNO2的模擬廢水富集NOB發現,當FNA= 0.25mg/L時,NOB活性降低65%.Wang等[9]發現當FNA=0.24mg/L時,可完全抑制富含NOB的活性污泥.Katsou等[10]處理有機物發酵液和城市污水混合液時發現,當FA濃度介于0.19~1.52mg/L時NOB活性降低35~65%.

生化反應動力學最直接地體現基質降解速率和反應物生成速率的變化關系,進而描述微生物活性.因此,通過抑制動力學模型,可清楚反應微生物受基質抑制情況.一些文獻對比了幾種不同的基質抑制動力學模型.如:Tanyolac等[11]通過非線性擬合對比分析了幾種抑制動力學模型,最終發現Edwards[12]模型能夠較好描述硫酸銨對廢水好氧生物處理過程中微生物的抑制作用.目前,大多研究集中于FNA對短程硝化污泥動力學研究[11-16],而較少的文獻從數理統計學方面評價不同動力學模型描述FNA抑制活性的適宜程度.

因此,本試驗在實現富集基礎上,基于動力學抑制模型,考察FNA對活性的抑制影響,進而對比統計學結果,獲得最優抑制動力學模型和動力學常數值,以指導生物脫氮技術在理論研究及實際工程中的應用.

1 生化反應抑制動力學模型

目前表征FNA抑制NOB活性動力學模型主要包括以下5種.

(1)Haldane模型

為通過動力學形式解釋微生物利用具有抑制性功能的底物,1968年,Andrews[17]提出底物濃度對比增長速率的影響可以通過式(1)表示.該模型是在1930年Haldane[18]認為酶和底物形成帶有兩個底物分子的惰性酶-底物復合物,該復合物對酶產生抑制作用的基礎上推導得出[19-20].

式中:為底物濃度(mg/L);為底物的比降解速(d-1);max為微生物未被抑制時的最大比降解速率(d-1);S為飽和常數,數值上等同于微生物未被底物抑制時底物最大比降解速率一半所對應的最小底物濃度(mg/L);I為抑制常數,數值上等同于微生物被底物抑制時底物最大比降解速率一半所對應的最大底物濃度(mg/L).

(2)Aiba模型

1968年,Aiba等[21]研究酒精發酵生化反應過程中,發現了發酵產物(酒精)對生化反應具有抑制作用,提出產物抑制理論和抑制模型,如式(2)所示.

式中:為產物濃度(mg/L);I為抑制常數;式中其余符號定義見Haldane模型,本文不再贅述,下同.

1970年,Edwards[12]認為Aiba提出產物抑制的指數關系同樣可用來描述相關底物抑制,因此,Edwards將式(2)修正為式(3),文獻[9]仍將該模型稱為Aiba模型.

(3)Edwards-1#模型

1970年,Edwards[12]提出公式(4)用于描述基質底物對生化反應的抑制關系.該方程是基于高濃度葡萄糖和半乳糖的抑制動力學和Haldane[18]對惰性酶底物復合物假設研究基礎上提出來的.為區分兩個Edwards模型,故將該模型命名為Edwards-1#,下同.

式中:為抑制常數.

(4)Edwards-2#模型

1942年,Teissier[22]通過研究底物濃度對微生物比增長速率的影響提出式(5),該公式描述了底物濃度對細菌增長具有刺激作用.

1970年,Edwards將Teissier假設與高濃度底物抑制作用相結合,建立了Edwards-2#模型,如式(6)所示.

(5)Luong模型

1987年,Luong[23]在研究丁醇作為基質底物對酵母菌生長過程的抑制作用基礎上,建立了Luong基質抑制模型,該模型被廣泛用于描述基質濃度對微生物生長過程的影響,其表達式如公式(7)所示:

式中:m為微生物的凈生長速率停止時的底物濃度(mg/L);為Long系數;

(6)Han-levenspiel模型

1988年,Keehyun Han與Octave Levenspie[24]在Monod模型基礎上共同提出了Han-levenspiel模型,該模型認為在高濃度底物濃度條件下,微生物活性被完全抑制,微生物停止增長,其表達式如公式(8)所示:

式中:,均為常數,其取值與基質對微生物抑制類型有關;

2 材料與方法

2.1 試驗裝置及運行方式

本試驗采用有效容積為7L(富集階段)和3L(FNA抑制批次試驗階段)的SBR1和SBR2兩種類型反應器. SBR1運行方式:瞬時進水(1min),硝化(通過在線監測DO值實時控制硝化終點),靜置沉淀(30min),排水(5min).第2階段試驗采用有效容積為3L的SBR反應器. SBR2運行方式:瞬時進水(1min),硝化(硝化時間為8h),靜置沉淀(30min),排水(5min).

2.2 試驗用水、接種污泥及水質分析項目

試驗用水采用人工模擬廢水,其水質特性見表1.原水采用去離子水,進水NO2--N通過投加NaNO2溶液實現,初始pH值通過1mol/L鹽酸(HCl)溶液和1mol/L氫氧化鈉(NaOH)溶液調節.其他成分如下:0.4gNaHCO3,0.9g KH2PO4,1.2g K2HPO4,以及0.9mL微量元素,每升微量元素中含有: 1.25gEDTA, 0.55gZnSO4?7H2O, 0.4gCoCl2?6H2O, 1.275gMnCl2? 4H2O, 0.4gCuSO4?4H2O, 0.05gNa2MoO4?2H2O, 1.375gCaCl2? 2H2O, 1.25gFeCl3?6H2O, 44.4gMgSO4? 7H2O.此外,硝化過程中DO控制在4~4.5mg/L,采用加熱棒控制反應器內混合液溫度.

第1階段試驗采用的污泥取自蘭州市西固區蘭煉污水處理廠氧化溝好氧段污泥,具有良好生物脫氮性能,初始混合液揮發性懸浮固體濃度(MLVSS)為3323mg/L.第2階段試驗以第1階段中已富含NOB的活性污泥為研究對象,MLVSS為(1485±35) mg/L.

NO2--N、NO3--N、混合液懸浮固體濃度(MLSS)及MLVSS均采用國家規定的標準方法[25];pH值、DO和溫度通過WTW-Multi3420實時監測;活性污泥經過預處理后采用掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope, SEM)進行觀察.

宏基因組物種注釋和豐度分析:①污泥樣品的Scaffolds/Scaftigs序列與NCBI-NT數據庫中的細菌、古菌、真菌和病毒序列進行BLASTN比對(E值設定為<0.001).②通過MEGAN[26]軟件中采取“最低共同祖先”算法[27]將參考序列分為不同物種分枝前的最后一級共同分類,作為目標序列的物種分類注釋信息.③結合Saffolds/Scaftigs序列在各樣本中的豐度數據,獲得各樣本在各個分類等級上的相對豐度分布表.

廢水中FNA濃度是NO2--N濃度、溫度和pH值三者的函數,其關系為(式9):

式中:[NO2--N]為NO2--N濃度;為溫度;pH為溶液pH值.

2.3 試驗方案

試驗共運行446個周期,根據不同的運行狀況可分為兩個階段.第1階段試驗(1~419周期)——富集.本階段試驗通過梯度增加進水NO2--N濃度實現的快速富集,具體運行條件見表1.

第2階段試驗(420~446周期)——FNA對抑制動力學研究.本階段試驗以第1階段中富含的活性污泥為研究對象,通過設定不同NO2--N濃度、pH值和溫度,以獲得不同FNA濃度,通過批次試驗,考察不同FNA濃度梯度下,FNA對活性的影響.具體運行條件見表2.并通過上述6種抑制動力學模型進行描述,最終建立FNA濃度對活性抑制動力學模型.

表1 NOB富集過程運行條件

表2 批次試驗條件

3 結果與討論

3.1 Nitrobacter的富集培養

圖1為富集階段SBR系統硝化開始、結束時NO2--N濃度、亞硝態氮氧化速率(NiOR)以及NO2--N去除率的變化規律.試驗運行過程中,進水NO2--N濃度從10mg/L梯度升高到700mg/L.可以看出,硝化結束時NO2--N濃度均低于5mg/L,平均值為2.07mg/L,整個試驗周期NO2--N去除率均達到98%以上,系統具有良好的脫氮性能.此外,由于進水NO2--N濃度的增加,NiOR逐漸增加[0.32mg/ (L·min)→1.93mg/(L·min)],呈正相關.當NO2--N3700mg/L時,NiOR始終維持在1.80mg/(L·min)以上,表明SBR系統具有良好的亞硝酸鹽氧化性能.

圖1 Nitrobacter富集培養階段SBR系統硝化性能

對微生物16S rRNA基因的特定區域進行靶向測序,獲得SBR系統內微生物群落的具體組成結構(圖2).通過Origin9.0軟件,對各樣本中的優勢物種(取總體豐度前30位物種)在屬水平上分析并繪制柱狀圖.分析發現:各平行樣在屬水平上微生物類型基本相同,其中平均相對豐度為40.3%.此外,基因測序結果顯示其余菌屬在污泥微生物群落中占比均低于5%,表明經過富集培養后SBR系統污泥微生物中占絕對優勢地位.

為了更深入觀察富集后形態特征,采用掃描電鏡(SEM)觀察活性污泥菌屬細胞表面形態(圖3).結果表明, 富集后污泥形態規則,邊界清晰,呈顆粒狀.活性污泥系統中以桿狀菌及梨狀菌屬為主[(0.5~0.8)′(1.0~2.0)],符合文獻[28]中關于形態與大小描述.

圖2 SBR系統微生物群落組成結構

圖3 Nitrobacter富集成功后SEM圖

3.2 FNA對Nitrobacter氧化性能影響

圖4為不同FNA濃度條件下硝化反應開始、結束時NO2--N濃度,轉化率及其氧化量的變化規律.試驗過程中,通過改變進水NO2--N濃度、溫度以及pH值來提高FNA濃度.隨著運行周期的增加,進水FNA濃度逐漸增加,硝化反應開始和結束時NO2--N濃度均呈現增加的趨勢.這是由于相同硝化反應時間內隨著進水NO2--N濃度增加導致曝氣結束時NO2--N未反應完全.此外,當FNA￡0.1mg/L時, NO2--N轉化率均維持在99%以上,同時NO2--N氧化量達到最大,為709.4mg/L.當FNA>0.1mg/L時,NO2--N轉化率及其氧化量逐漸下降,表明FNA對的活性開始產生抑制作用.張宇坤等[29]研究表明,當FNA=0.01mg/L時NOB活性逐漸降低.分析原因:NOB生長環境及其污泥濃度均可影響NOB活性,本試驗經過富集培養后占活性污泥菌群比例較高,因此采用此類活性污泥進行FNA對抑制影響動力學研究,更具有代表性.

圖4 不同FNA條件下系統內NO- 2-N去除性能

3.3 FNA抑制Nitrobacter活性動力學

為了更好地描述FNA對活性的抑制影響,采用上述6種抑制動力學模型對試驗數據進行擬合,擬合結果如圖5所示.6種動力學模型均呈現出先增加后降低的趨勢,故均可用于描述FNA對活性的抑制影響.當FNA<0.18mg/L,隨著FNA濃度的增加,SNiOR急劇增加,表明在此FNA濃度范圍內, FNA對活性具有促進作用.當FNA濃度介于0.19~0.64mg/L之間時,SNiOR呈現降低的趨勢,表明FNA對活性產生顯著抑制作用,活性逐漸降低.當FNA30.7mg/L時,SNiOR為零,完全失活.

圖5 FNA對Nitrobacter活性抑制動力學擬合

為了更精確的比較6種動力學模型對試驗數據的擬合效果,基于統計學理論,對6種模型的動力學參數和擬合效果進行分析,選擇最適宜的動力學模型描述FNA對活性的影響.分析統計結果見表3.

基于統計學中方差分析對動力學參數值進行對比分析發現,Edwards-1#模型獲得的擬合結果不收斂,擬合失敗,因此,Edwards-1#模型不能用來描述FNA對NOB活性的影響.通過殘差平方和(RSS)與相關系數(2)對比分析,RSS和2均可描述試驗數據與擬合曲線的接近程度,RSS越小,擬合效果越好.2越大,試驗數據在擬合曲線附近越密集,曲線擬合程度越高.相對于Haldane模型,Aiba模型、Edwards-2#模型以及Luong和Han-Levenspiel模型的RSS較小,2較大,因此,Aiba模型、Edwards-2#模型、Luong以及Han-Levenspiel模型更適宜描述FNA對活性的抑制影響.基于方差分析,值與值均能夠預測自變量與因變量的關聯程度.值是回歸方程的顯著性檢驗,值表示試驗結果可信度,值越大,值越小,可表明自變量和因變量顯著相關,方程擬合度越好,且當<0.05時,自變量可用于預測因變量.5種模型擬合得到的值均小于0.001,但Han-Levenspiel模型值最小,值最大.因此,綜合RSS、2、值和值考慮,Han-Levenspiel模型描述FNA對活性抑制作用是最優的.

表3 5種抑制動力學模型參數以及統計學分析

3.4 關于FNA和NO2--N誰是Nitrobacter真正抑制劑的探討

1976年,Anthonisen等[7]研究表明,FNA對NOB的抑制閾值為0.2~2.8mg/L.此后,眾多學者關于FNA和NO2--N誰是NOB菌屬的真正抑制劑及其抑制濃度范圍進行了研究,但試驗結果和NOB真正抑制劑研究目前尚未達成共識.表4總結了現有文獻和本試驗關于FNA和NO2--N對NOB活性影響的研究現狀.Park等[13]基于抑制動力學模型研究亞硝酸鹽氧化抑制動力學發現,當pH值由8降為7時,q/qmax(比NO2--N利用速率/比NO2--N最大利用速率)顯著降低,表明pH值對NOB活性產生影響,認為FNA是NOB真正抑制劑.Vadivelu等[30]通過改變進水NO2--N濃度對比耗氧速率(SOUR)影響研究含73%活性污泥時發現,FNA抑制活性.Carrera等[31]對懸浮生物系統和附著型生物系統硝化過程研究發現,在恒定pH值和溫度條件下,高濃度NO2--N對NOB活性產生抑制作用,計算可得在該NO2--N濃度條件下FNA= 0.02mg/L,并未達到FNA抑制NOB濃度閾值[7].因此,認為NO2--N對NOB活性產生抑制作用.

表4 關于FNA和NO2--N抑制NOB文獻資料報道

圖6為本試驗pH值、、NO2--N和FNA濃度分別對活性的影響.由圖可知,不同pH值、、NO2--N和FNA濃度均對活性有影響.本試驗控制的pH值和條件下,pH和對活性產生一定的影響,在pH值為7.2左右,為24℃時活性最強[圖6(a,b)].此外,基于Han-Levenspiel抑制動力學模型,由圖6(c,d)可知,以FNA和NO2--N為抑制劑時, SNiOR擬合曲線均呈先升高后降低的趨勢,表明高濃度NO2--N和FNA對均產生抑制作用.因此,兩者均可抑制的活性.當以NO2--N為抑制劑時,NO2--N濃度較高時,SNiOR出現明顯波動,可決系數2較低,僅為0.76,曲線擬合程度較低.而以FNA為抑制劑時,SNiOR擬合曲線數據點在擬合曲線附近較緊密,2為0.90,曲線擬合程度較好.試驗表明,一定pH值和及高濃度NO2--N和FNA對均具有抑制作用,由于FNA為pH值、和NO2--N三者的函數,也就是說FNA綜合了NO2--N濃度、pH值和對活性的影響.在任何一個污水生物脫氮處理系統中,NO2--N,pH值和是客觀存在的基質和環境條件.因此,FNA作為抑制劑時能夠更加全面的反映NO2--N,pH值和三因素對活性的抑制作用,也可采用抑制動力學方程來描述.因此,相比于單一NO2--N濃度對活性的抑制影響,FNA對活性的抑制模型具有更好的實際應用價值.

4 結論

4.1 控制DO34mg/L,=25℃條件下,以NaNO2為唯一能源,通過梯度提高NO- 2-N濃度可實現的富集,經過419個周期,宏基因組物種注釋和豐度分析顯示占細菌總數40.3%,成為優勢菌種.

4.2 當FNA>0.1mg/L時,NO- 2-N轉化率及其氧化量逐漸下降,表明FNA對活性開始產生抑制作用,當FNA=0.7mg/L時,被完全抑制.

4.3 基于對Haldane、Aiba、Edwards-2#、Lunog和Han-Levenspiel抑制動力學模型的統計學分析發現,Han-Levenspiel模型能夠較好的描述FNA對抑制影響.

4.4 基于Han-Levenspiel模型對FNA與NO- 2-N分別作為抑制劑進行擬合分析發現,通過FNA大小表征抑制程度具有更好的實際意義.

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SUN Hong-wei1,2*, YU Xue1,2, LI Wei-wei3, QI Guo-ping3, MA Juan1,2, CHENG Yong-zhi1,2, LV Xin-tao4

(1.School of Environmental and Municipal Engineering, Lanzhou Jiaotong University, Lanzhou 730070, China；2.Gansu Sewage Treatment Industry Technical Center, Lanzhou 730070, China；3.Gansu Province Light Industry Research Institute, Lanzhou 730070, China；4.Research and Development Center of Beijing Drainage Group Technology, Beijing 100022, China)., 2018,38(11)：4246~4254

A sequencing batch reactor (SBR) was operated in this study to investigate the inhibitory kinetics of free nitrous acid (FNA) on. At the beginning of the experiment, FNA concentration in influent was changed to enrich. Then, the sludge of enrichmentwas employed to study the variation law of the specific nitrite oxidation rate (SNiOR) during nitrite oxidation process of batch tests. Meanwhile, metagenomic species annotation and abundance analysis showed thataccounted for 40.3% of the total bacterial population. Furthermore, kinetic model of FNA inhibition onactivity was fitted for statistical analysis. The results showed that the SNiOR increased rapidly with the increase of FNA concentration when￡0.1·mg/L while decreased with the increase of FNA concentration as FNA>0.1mg/L. In particular, the SNiOR was maintained at 0gN/(gVSS·d) when FNA concentration was higher than 0.7mg/L, implying thatactivity was completely inhibited. Statistical analysis results showed that compared to Haldane, Aiba, Edwards-1#, Edwards-2# and Luong inhibition kinetics models, Han-Levenspiel model was the most suitable one for describing the inhibitory effect of FNA onactivity. The statistical constants, e.g., residual square sum (RSS) correlation coefficient (2), F value of the analysis of variance and confidence degree (P) was 0.02, 0.90, 78.1and 3.29×10-12, respectively. The dynamic constant values, e.g., maximum specific nitrite oxidation rate (max), half saturation constant (S) and critical inhibition constant (m) was 1.57gN/(gVSS·d), 0.01mg/L and 0.66mg/L, respectively.

free nitrous acid；；specific nitrite oxidation rate；inhibition kinetic；metagenome

X172,X703.5

A

1000-6923(2018)11-4246-09

孫洪偉(1976-),男,黑龍江齊齊哈爾人,教授,博士,主要從事污水生物脫氮研究.發表論文40余篇.

2018-04-11

國家自然科學基金資助項目(51668031);蘭州交通大學“百名青年優秀人才培養計劃”項目(152022);甘肅省重點研發計劃-工業類項目(17YF1GA009)

* 責任作者, 教授, 12821306@qq.com