銅與毒死蜱復合污染對淡水綠藻的毒性效應

徐冬梅,柯 薇,王彥華

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銅與毒死蜱復合污染對淡水綠藻的毒性效應

徐冬梅1,柯 薇1,王彥華2*

(1.浙江樹人大學生物與環境工程學院,浙江 杭州 310015；2.浙江省農業科學院農產品質量標準研究所,浙江 杭州 310021)

重金屬及農藥殘留在水環境中被頻繁檢測出,其復合污染對環境生物的聯合毒性有別于單因子的生物效應.以淡水綠藻為受試生物,比較分析了有機磷農藥毒死蜱(Chlorpyrifos)和重金屬銅的單一及復合暴露對蛋白核小球藻急性毒性、細胞通透性及抗氧化應激的影響.銅、毒死蜱72小時單一暴露對小球藻的EC50分別為0.68和12.71μmol/L,藻細胞葉綠素含量隨污染物濃度的增大而降低,細胞通透性隨污染物濃度的增大而增強,藻細胞活性氧和抗氧化酶被顯著誘導.利用相加指數法(Additive Index, AI)確定銅、毒死蜱聯合暴露對小球藻急性毒性的聯合作用類型為拮抗作用,這與小球藻ROS產生量及抗氧化酶等指標的顯著性水平分析結果一致.

銅；毒死蜱；淡水綠藻；急性毒性；通透性；氧化應激

有機磷殺蟲劑毒死蜱是一種高效、廣譜含氮雜環類殺蟲殺螨劑.作為高毒有機磷農藥的主要替代品,近年來毒死蜱全球銷量在所有殺蟲劑中穩居前三,居有機磷殺蟲劑第一位,該農藥在我國的年產量現已超過4萬t[1].隨著使用量的增加,毒死蜱母體及代謝產物有可能通過多種途徑進入水體,目前已在世界各國地表水環境檢測到較高濃度毒死蜱的存在[2-4].盡管毒死蜱比已禁止使用的有機磷農藥對人畜的毒性要低,但對于多數水生生物而言,毒死蜱仍屬于高毒性物質并且可以通過生物積累和生物放大作用對水體食物鏈產生影響[5-7].同時,我國現階段環境污染的實際情況是有機農藥和重金屬污染物在多種環境介質中(包括水環境、土壤環境)大量共存,從而產生復合效應,可以大大改變彼此的生理活性或毒性,其復合污染構成了生態環境和人類健康的潛在威脅,這引發了人們對其聯合毒性作用的擔憂.重金屬銅是植物生長和人體生命活動必需的微量元素,然而銅在環境中的過量累積不僅會導致暴露生物的毒性效應[8],還會對人體健康造成不良影響[9].目前有關重金屬與農藥共存條件下對水生生物的復合污染效應仍鮮見報道.

淡水綠藻作為水環境監測評價的重要指示生物,廣泛應用于環境污染的生態毒性評價.鉻等重金屬類能夠誘導柵藻體內活性氧自由基(ROS)的產生及脂質過氧化等藻細胞毒性[10],已有研究發現供試40種農藥中以光合作用抑制類除草劑對淡水綠藻的毒性最強[11].本文選用水環境中常見的代表性有機磷農藥毒死蜱和重金屬銅為研究對象,以水生態初級生產者淡水綠藻為受試生物,系統研究毒死蜱、銅單一及復合暴露對蛋白核小球藻急性毒性、細胞膜通透性、葉綠素含量及抗氧化應激的影響,探究毒死蜱、銅聯合作用的毒性效應和生態風險,解析二者聯合毒性的作用機制.以期為復合污染物的水環境生態風險評價提供科學依據.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試蛋白核小球藻購自中國科學院水生生物研究所,毒死蜱原藥由南京紅太陽集團有限公司提供(純度>95%),熒光素二乙酸酯(FDA)和2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(H2DCFDA)購自sigma Aldrich公司,抗氧化酶等試劑盒購自南京建成生物工程研究所,試驗所用硫酸銅等其余試劑均為分析純,水為二次亞沸蒸餾水.

1.2 藻細胞的預培養

在無菌條件下將藻種接種至水生4號培養基中,于PRX-350B型智能人工氣候箱中恒溫光照培養至對數生長期,并進一步擴大培養.培養條件為溫度25℃,光暗比12h:12h,光照3000~4000lx靜止培養,每天定時搖動5~6次,以減少藻細胞貼壁現象.預培養3代,鏡檢細胞正常,進入對數生長期進行試驗.

1.3 藻類毒性試驗及相關指標測定

將處于對數生長期的蛋白核小球藻接種到100mL錐形瓶中,實驗初始藻細胞密度約7.0×105個 / mL,總體積50mL.根據預實驗的結果設置毒死蜱、銅單一暴露和毒性1:1復合暴露濃度如表1所示,每個處理3次重復.

表1 銅、毒死蜱單一及復合暴露的試驗設計

藻細胞于污染物中暴露72h后測定相關指標.葉綠素含量測定參照文獻[12];藻細胞膜通透性參照Dorsey 等報道的加入熒光素二乙酸酯(FDA)后檢測熒光值的方法[13];活性氧自由基(ROS)含量通過加入2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(H2DCFDA)探針來測定[14].藻細胞抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和脂質過氧化產物丙二醛(MDA)含量采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進行測定.

1.4 數據分析

采用SPSS17.0進行數據的分析與處理,對藻細胞膜通透性、葉綠素含量等的差異用方差檢驗,并用Duncun'sNew Multiple Test做濃度之間的多重比較,顯著性水平為<0.05.采用Marking 的相加指數法評價銅、毒死蜱對小球藻急性毒性的聯合作用類型.為生物毒性相加作用之和,=m/1+m/1(1).式中1、1和m、m分別為A、B毒物的毒性(EC50)和混合物毒性中各毒物的毒性(EC50).然后用以下公式將轉換成相加指數(AI):當￡1時,AI=(1/)?1.0 (2);當>1時,AI=(?1)+1.0 (3).最后用相加指數AI評價毒物的聯合效應.AI>0時為協同作用;AI<0則為拮抗作用;AI=0為相加作用.

2 結果與分析

2.1 銅、毒死蜱單一及復合暴露對綠藻的急性毒性

圖1 銅、毒死蜱對淡水綠藻72h急性毒性效應的劑量效應擬合曲線

利用非線性最小二乘擬合(NLSF)模塊下的DseRes模型擬合工具對藻細胞72h生長抑制數據進行非線性擬合,進而求得銅、毒死蜱對藻生長抑制率的濃度-效應曲線(圖1)及其單一、復合暴露的EC50值和相關參數(表2).由表2數據可見,銅、毒死蜱單一暴露對小球藻72h-EC50分別為0.68和12.71μmol/L;而毒性1:1復合暴露的銅、毒死蜱對小球藻EC50-72h分別為0.46和10.52μmol/L.相加指數法求得銅、毒死蜱復合暴露對小球藻急性毒性的相加指數AI<0,由此判斷二者聯合作用類型為拮抗作用.證明水環境中多種污染物聯合作用的復雜性.修瑞琴等采用相加指數法評價砷與鎘、鋅離子對斑馬魚的聯合毒性發現,As3+與Cd2+、Zn2+共存時的聯合毒性均為拮抗作用,而Cd2+與Zn2+的聯合毒性主要為毒性劇增的協同作用[15].本文的結果表明重金屬銅和農藥毒死蜱聯合暴露于藻細胞產生了交互作用.

表2 DseResp模型參數、EC50值和聯合作用類型

注:2、1分別為擬合曲線的上、下漸近線;log0為擬合曲線中點(平均校正死亡率=50%處)的縱坐標;為擬合曲線中點(平均校正死亡率=50%處)的斜率;Span=abs(1-2).

2.2 銅、毒死蜱對藻細胞葉綠素含量和通透性的影響

綠藻的光合作用色素主要是葉綠素a、葉綠素b、葉黃素和胡蘿卜素.其中葉綠素a是評價環境污染物對藻類光合作用呼吸速率影響的理想指標;而葉綠素b的含量則可以作為測定藻類光合作用和呼吸速率的一個補充[16].銅、毒死蜱暴露72h后小球藻葉綠素a(Chla)和葉綠素b(Chlb)含量見表3.低濃度即0.1μmol/L銅、5.0μmol/L毒死蜱單一暴露組和銅:毒死蜱0.14:2.50復合暴露的藻細胞葉綠素含量較對照有所增加,此后隨著銅、毒死蜱暴露濃度的增大,Chla和Chlb含量顯著下降.其中銅單一暴露的小球藻葉綠素b在整個試驗濃度范圍內變化均不顯著,而其余作用組隨銅、毒死蜱單一及復合暴露濃度的增加,葉綠素含量下降明顯.總體而言,銅、毒死蜱單一暴露對藻細胞Chla的影響程度大于二者的復合作用;而Chlb則表現出稍有不同的變化趨勢.

表3 銅、毒死蜱單一及復合暴露對藻細胞葉綠素含量的影響

沒有熒光活性的熒光素二乙酸甲酯(FDA)難以通過完整的細胞膜,其可被體內脂酶代謝生成具有熒光活性的熒光素,熒光素的熒光強度可用以表征細胞膜的完整性和通透性[17].單位時間內測定的熒光強度越大,表明藻類細胞的代謝活性越高,細胞膜的通透性越強[18].銅、毒死蜱單一及復合暴露72h后對藻細胞通透性的影響如圖2所示.由圖可見,隨著作用濃度的增加,銅、毒死蜱單一及復合暴露增大了藻細胞的通透性.其中最大暴露濃度組,即銅0.8μmol/L,毒死蜱40μmol/L,銅:毒死蜱1.10: 20.00μmol/L暴露組藻細胞通透性分別為對照的2.3,3.3和3.0倍.

圖2 銅、毒死蜱對藻細胞通透性的影響

2.3 銅、毒死蜱對藻細胞活性氧含量和抗氧化反應的影響

重金屬、農藥污染對水生生物的毒性作用機制之一,是導致生物體內產生大量的ROS,造成生物體的氧化損傷,并且促發抗氧化系統如超氧化物歧化酶(SOD)等的活性[19].銅、毒死蜱單一及復合暴露的ROS 產生量如圖3所示.由圖3可見,0.1~0.8μmol/L銅和5~40μmol/L毒死蜱單一暴露的藻細胞ROS誘導產生量隨污染物濃度增大而增大的趨勢較二者復合暴露更為明顯,其中最大濃度組的銅、毒死蜱單一及復合暴露誘導藻細胞ROS產生量分別為對照組的2.6、2.8和3.1倍.

圖3 銅、毒死蜱對藻細胞活性氧產生量的影響

由圖4、圖5污染暴露下小球藻SOD、GSH-Px活性影響可見,銅、毒死蜱單一暴露的小球藻SOD、GSH-Px活性被顯著誘導,尤其以銅、毒死蜱單一暴露對GSH-Px活性的激活效應更為明顯.相比之下,銅、毒死蜱復合暴露的SOD和GSH-Px激活作用不顯著.

圖4 銅、毒死蜱對藻細胞SOD活性的影響

圖5 銅、毒死蜱對藻細胞GSH-Px活性的影響

圖6銅、毒死蜱對藻細胞脂質過氧化產物MDA含量的影響結果表明,銅單一暴露誘導藻細胞MDA的產生最為明顯,而毒死蜱單一和銅、毒死蜱復合情況下藻細胞MDA產生量與對照相比差異并不顯著.

3 討論

復合污染已經成為各類環境介質中普遍存在的現象.當前重金屬、農藥仍然是水環境中兩類常見的污染物,其復合污染構成了對水生態環境和人類健康的潛在威脅[20].由于很多健康毒理效應無法用單一污染物的作用機理來解釋,多元復合污染物對環境生物的聯合毒性有別于單因子的生物效應已在眾多研究中得到證實[21-22].胡曉娜等研究證明, Zn2+的存在降低了除草劑異丙甲草胺對斜生柵藻的生長抑制作用,異丙甲草胺與Zn2+的聯合毒性作用為低濃度相加,高濃度拮抗的作用類型[23].重金屬銅與除草劑2,4-滴丙酸復合污染誘導斜生柵藻產生ROS和抗氧化酶活性高于重金屬和農藥各自單一暴露的情形[17].本文應用相加指數法研究發現銅、毒死蜱以毒性1:1復合暴露對小球藻急性毒性的聯合作用類型為拮抗作用.由多重比較分析結果,發現銅、毒死蜱復合暴露對小球藻ROS產生量及抗氧化酶等指標影響的顯著性水平小于二者各自單一作用的情形,在一定程度上支持了銅、毒死蜱復合暴露對小球藻的毒性為拮抗作用的結論.與謝榮等應用相加指數法獲得的有機磷農藥丙溴磷和重金屬銅毒性1:1復合暴露對海洋微藻(三角褐指藻、鹽藻和青島大扁藻)的聯合毒性類型相同[24].這可能是由于毒死蜱競爭銅與酶蛋白的結合點位,從而在一定程度上抑制了銅毒性作用的結果.吳宗凡等應用等效線圖解法的獨立作用模型預測了重金屬、有機磷農藥復合暴露對鹵蟲急性毒性,發現不同配比的重金屬、有機磷農藥對鹵蟲的聯合作用類型均為拮抗作用[25].在復合污染脅迫下,農藥與重金屬聯合暴露的生物毒性類型主要取決于農藥對重金屬生物可利用性的影響.此外,污染物對生物的毒害效應還取決于污染物濃度水平的組合關系,因此,對于復合污染的研究,也應重點考慮污染物的濃度組合及濃度組合的交互作用[26].

4 結論

4.1 隨著銅、毒死蜱單一暴露濃度的增大,藻細胞葉綠素含量降低,細胞通透性增強,活性氧和抗氧化酶活性被顯著誘導.

4.2 銅、毒死蜱聯合暴露對小球藻急性毒性的聯合作用類型為拮抗作用,這與污染暴露下小球藻ROS產生量及抗氧化酶等指標的顯著性水平分析結果一致.

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Toxiceffects of the co-exposure to Cu and chlorpyrifos toward the freshwatergreen algae.

XU Dong-mei1, KE Wei1, WANG Yan-hua2*

(1.College of Biological and Environmental Engineering, ZhejiangShuren University, Hangzhou 310015, China；2.Institute of Quality Standards for Agricultural Products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China)., 2018,38(11)：4348~4353

The residues of various heavy metals and pesticideshave been frequently detected in water environments, however, theirjoint toxicity is different from individual single toxicity. We evaluated the effects of single and co-exposure of organophosphorus pesticide chlorpyrifos and heavy metal Cu on acute toxicity, cellular permeability and anti-oxidative stress of freshwater green algae. The 72h-EC50for single exposure of Cu and chlorpyrifos to chlorella were 0.68 and 12.71μmol/L, respectively. The chlorophyll content of algal cells was decreased accordingly with the increasing concentration of Cu and chlorpyrifos, however, the cell permeability was increased with the higher concentrationof Cu and chlorpyrifos. The reactive oxygen species (ROS) and antioxidant enzymes were significantly induced in algae cells. As revealed by the additive index method, the joint effec of Cu and chlorpyrifos on acute toxicity wasin antagonistic mode, in consistent with the ROS production and antioxidant enzyme in chlorella vulgaris.

Cu；Chlorpyrifos；freshwater green algae；acute toxicity；permeability；oxidative stress

X503.2

A

1000-6923(2018)11-4348-06

徐冬梅(1974-),女,吉林長春人,教授,博士,主要從事生態毒理學方面的研究.發表論文40余篇.

2018-04-08

浙江省自然科學基金資助項目(LY18B070005);農業部農藥殘留檢測重點實驗室開放課題(2015PRG05);浙江樹人大學中青年學術團隊項目

* 責任作者, 副研究員, wangyanh79@163.com