高效銅綠微囊藻溶藻菌WJ6的分離鑒定及溶藻特性

洪桂云,馬少雄,王 佳,張 瑾

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高效銅綠微囊藻溶藻菌WJ6的分離鑒定及溶藻特性

洪桂云,馬少雄,王 佳,張 瑾*

(安徽建筑大學環境與能源工程學院,安徽省水污染控制與廢水資源化重點實驗室,安徽 合肥 230601)

以銅綠微囊藻為研究對象,從富營養化水體分離了一株高效溶藻菌,通過分析形態學、生理生化特征及16S rDNA序列比對,鑒定了該溶藻菌株,分析了該菌株對銅綠微囊藻的溶藻方式、溶藻特性及其不同培養時期、不同濃度菌液及不同環境因子對溶藻效果的影響,并探討了其可能的溶藻機制.研究表明:WJ6屬于沙雷氏菌屬(sp. GenBank登錄號為KY462187);溶藻菌WJ6以胞外釋放溶藻物質為主直接溶藻為輔的溶藻方式;溶藻菌WJ6處于對數期時的溶藻率最高達87.50%;菌液濃度達1.4×109CFU/mL以上,溶藻率最高為95.69%;在30℃、pH8條件下,溶藻率達90.00%;改良的基本培養基培養的溶藻菌溶藻率最高達98.50%;銨離子濃度大于2mol/L時,溶藻菌的溶藻率98.33%;當鹽度為0.5%時,溶藻率較高為92.77%.溶藻菌株WJ6是1株高效溶銅綠微囊藻菌,在富營養化治理方面具有較好的應用前景.

溶藻菌；分離鑒定；銅綠微囊藻；溶藻特性

目前,由藻類引起的水華和赤潮在世界范圍內頻繁爆發[1].銅綠微囊藻是富營養化水體引起水華現象的優勢藻種之一[2],因其有毒產物藻毒素毒性大、難降解、可被生物富集,已成為漁業生產及水環境中的公害[3-4].中國的三大富營養湖泊(太湖、滇池、巢湖)常常爆發銅綠微囊藻水華,帶來了嚴重的社會、經濟以及環境問題.鑒于銅綠微囊藻的各種危害,對其防治顯得越來越重要.目前藻類控制技術可歸結為: 提取的DNA為模板,以細菌的16S rDNA 通用物理方法、化學方法及生物防治,其中溶藻微生物防治技術因具有成本低、安全性好的潛能,引起了越來越多研究人員的關注[5].國內外學者嘗試從自然水體或活性底泥中直接分離、純化溶藻細菌,目前已報道的溶藻菌有假單胞菌屬、交替單胞菌、芽孢桿菌屬等[6-16],用此方法篩選的菌種是土著菌,符合當地細菌增殖環境營養條件、可較好地防止菌種退化、功能消失等.因此本文從巢湖處于水華爆發期的富營養化水體中分離和鑒定了一株具有高效溶銅綠微囊藻能力的細菌,并分析其對我國常見的水華藍藻優勢種銅綠微囊藻的溶藻特性,以期為巢湖富營養化水體藍藻爆發的生物控制提供優勢的土著菌種資源和技術支持.

1 材料與方法

1.1 供試藻種

銅綠微囊藻(FACHB-1326)購自中科院水生生物研究所藻種保藏中心,藻種活化后接種于BG11培養基,置于恒溫光照培養箱中靜置培養.溫度(25± 1)℃,光照強度 2000~2500Lx,光暗比為12h:12h.

1.2 方法

1.2.1 溶藻菌的分離與鑒定 所分離的溶藻菌來自富營養化水體.水樣經0.8μm濾膜粗過濾,濾液再經0.22μm纖維濾膜過濾,收集0.22μm濾膜,剪成小份,投入牛肉膏蛋白胨培養基中,150r／min,30℃,培養24h.按1:9體積加入預培養一周的供試藻液中進行共培養初步篩選溶藻菌,培養條件同銅綠微囊藻的培養條件.設空白對照,空白對照為不加菌液,加等體積的牛肉膏蛋白胨液體培養基.取明顯黃化藻液,平板劃線分離單菌落,取菌落形態不同菌落,編號為WJ1-20,保種備用.對純化得到的溶藻菌株WJ1-20進行復篩,黃化最明顯的菌株為高效溶藻菌,對高效溶藻菌株進行革蘭氏染色,于光學顯微鏡下觀察.

用TaKaRa試劑盒提取溶藻菌株總基因組DNA,瓊脂搪凝膠電泳分析所提取的總DNA.以引物對細菌的基因組進行PCR擴增,其中上游引物(P1)為5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,下游引物(P2)為5’-ACGGCTACCTTGTT ACGACTT-3’;擴增條件為:94℃預變性5min; 94℃ 30s, 55℃30s, 72℃ 2min, 30個循環;72℃延伸10min.PCR擴增得到的目的片段經瓊脂糖凝膠電泳分離后,在紫外燈下切割收集長度為1500bp左右的凝膠,經Axygene膠回收試劑盒純化后,送上海生物工程有限公司測序.將測得序列用DNAstar軟件編輯后,提交到GenBank.在NCBI中利用Blast軟件與GenBank中已知的16S rDNA序列進行同源性比較,確定溶藻菌株的種屬.

1.2.2 溶藻菌株生長曲線的測定 將溶藻菌株接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基,30℃、150r/min的培養,每2h測定其在600nm處的吸光值,將所測的600nm值與其對應的培養時間作圖,繪制生長曲線.

1.2.3 溶藻菌株溶藻機理初步研究 (1) 溶藻菌株溶藻方式培養溶藻菌株株至對數生長期,分別取10mL溶藻菌培養液采取5種處理方式:原菌液(T1);溶藻菌培養液經8000r/min,4℃離心5min,用0.22μm玻璃纖維濾膜過濾上清液 2 次(T2);培養液經8000r/min,4℃離心5min,棄上清液,用牛肉膏蛋白胨液體培養基定容至10mL,使菌體重新懸浮(T3);高溫高壓(121℃,20min)處理的原菌液(T4) ;超聲(100W,10min)破碎后的原菌液(T5);分別與銅綠微囊藻共培養.空白對照加等體積的牛肉膏蛋白胨液體培養基,各組分別設置3個平行樣.培養條件:溫度(25±1)℃,光暗比為12h:12h.采用丙酮提取分光光度法[17]測定第5d葉綠素a含量,按公式1計算溶藻率.

式中:對照組Chla為對照組的葉綠素a濃度,處理組Chla為處理組的葉綠素a濃度.

(2) 溶藻菌株溶藻效果的電鏡觀察為觀察溶藻菌株溶藻過程中藻細胞結構變化,各取對照組和實驗組藻液10mL,5000r/min離心5min,收集藻體并用2.5%戊二醛在4℃冰箱過夜.倒掉固定液,用0.1mol/L、pH值為7.0的磷酸緩沖液漂洗藻體.用梯度濃度的乙醇(50%、60%、70%、80%、90%、95%)對藻體進行脫水處理,再用100%的乙醇脫水,然后放到真空干燥機干燥,鍍金,在掃描電鏡下觀察藻細胞形態變化.

1.2.4 溶藻菌株溶藻特性研究 (1)不同生長時期對溶藻菌株溶藻效果的影響分別取培養至延滯期(1h)、對數期(4h)、穩定期(12h)及衰亡期(28h)的菌液,按1:9體積加入預培養一周的供試藻液中共培養,空白對照(CK)加10mL的牛肉膏蛋白胨液體培養基.測定第5d葉綠素a含量并計算溶藻率.

(2)菌液濃度對溶藻效果的影響將溶藻菌株培養至對數生長期( 2×109cells/mL),將溶藻菌原液分別10-1倍稀釋,10-2倍稀釋,10-3倍稀釋,10-4倍稀釋,分別按1:9體積加入預培養一周的供試藻液中共培養,空白對照(CK)加10mL牛肉膏蛋白胨液體培養基.測定第5d葉綠素a含量并計算溶藻率.

(3) 不同環境因子對溶藻效應的影響將溶藻菌株置于30℃、150r/min振蕩培養24h,用NaOH和HCl溶液調節藻液pH值至5.0、6.0、7.0、8.0和9.0,空白對照(CK)加10mL牛肉膏蛋白胨液體培養基.接種5d 后測葉綠素a含量研究pH值對微囊藻溶藻效果的影響.

溫度對微囊藻溶藻效果的影響試驗步驟同pH值影響試驗,分別選擇20、25、30℃ 3個溫度條件進行.

配制牛肉膏蛋白胨液體培養基、LB培養基、改良的基本培養基、BG11培養基、查氏培養基五種不同培養基,分別培養溶藻菌制成菌液,各取培養至對數生長期的溶藻菌菌液10mL加入到90mL預培養一周的銅綠微囊藻藻液中,進行溶藻實驗.空白對照(CK)加10mL牛肉膏蛋白胨液體培養基.接種5d后測葉綠素a含量研究不同培養基對微囊藻溶藻效果的影響.

在培養基中加入濃度分別為0、1、2、3、4、5、6、7mol/L的NH4Cl,質量分數分別為0%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、1%NaCl,研究不同銨離子濃度和鹽度條件下,溶藻菌的溶藻效果.各取培養至對數生長期的溶藻菌菌液10mL加入到90mL預培養一周的銅綠微囊藻藻液中,進行溶藻實驗.空白對照(CK)加10mL牛肉膏蛋白胨液體培養基.接種5d后測葉綠素a含量研究NH4Cl和鹽度對微囊藻溶藻效果的影響.

2 結果與分析

2.1 溶藻菌株的分離與鑒定

2.1.1 溶藻菌株的分離 將從富營養化水體中富集的細菌制成菌液與銅綠微囊藻共培養,經過初篩和復篩,有16株細菌對銅綠微囊藻有明顯的溶藻效果,其中一株菌株溶藻效果較強且穩定,命名為WJ6,供以下研究分析.

2.1.2 溶藻菌株WJ6形態及生理生化特征 菌株WJ6在牛肉膏蛋白胨固體培養基上30℃培養48h,菌落呈紅色,菌落較小,圓形,邊緣規則,表面光滑,濕潤,革蘭氏染色呈陰性,菌體短桿菌.過氧化氫酶,明膠液化試驗都為陽性,能夠利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇、乳糖并還原硝酸鹽.

2.1.3 溶藻菌株WJ6的16S rDNA序列分析 用TaKaRa試劑盒提取總基因組DNA,以細菌的16S rDNA通用引物對細菌的基因組進行PCR擴增,擴增得到的目的片段長約為1500bp(圖1).測序結果表明菌株WJ6的16S rDNA為1500bp.將WJ6的16S rDNA序列(GenBank中的登錄號為KY462187)與GenBank中已知16S rDNA序列進行Blast比對, Blast比對結果表明,菌株WJ6與沙雷氏菌屬的sp. TCR(EF070125.1)的同源性達到99%.結合菌株WJ6形態特征、生理生化實驗和16S rDNA序列分析,將溶藻菌株WJ6鑒定為變性菌綱,腸桿菌目,腸桿菌科,沙雷氏菌屬.

圖1 16S rDNA基因PCR擴增產物

泳道1為菌株WJ6的16S rRNA基因擴增產物;泳道2為DNA Marker SM0337(生工公司)

2.2 溶藻菌株WJ6的生長曲線

用無菌移液管吸取1mL培養的原菌液于200mL滅菌的培養基中,再于30℃、150r/min搖床培養,每隔2h取樣,用分光光度計在600nm處測菌液吸光度值,繪制生長曲線,如圖2所示.從圖2可知, WJ6菌株在0~2h處于停滯期,2~6h處于對數期,6~24h處于穩定期,24h后進入衰亡期.

圖2 溶藻菌WJ6的生長曲線

2.3 溶藻菌株WJ6的溶藻方式

考察菌液經離心、高溫滅菌及超聲破碎等5種不同處理方式的溶藻效果,結果如圖3.原菌液和無菌濾液的溶藻效果較好,溶藻率分別達到91.18%和88.24%,菌懸液的溶藻率為41.18%,溶藻菌株WJ6的菌懸液和無菌濾液均具有一定的溶藻效果.說明其既通過自身裂解藻細胞,也分泌溶藻物質來裂解藻細胞.溶藻菌WJ6的溶藻方式是直接溶藻與間接溶藻并存,主要為間接溶藻.而經高溫高壓處理后菌液對藻液作用后溶藻率僅為11.76%,說明胞外分泌物沒有熱穩定性,可能為蛋白質類物質.超聲破碎后的菌液溶藻率為64.71%,說明菌體被破碎后其胞外分泌物起了較強的溶藻作用,更進一步說明溶藻菌WJ6的溶藻方式為間接溶藻為主.

圖3 溶藻菌WJ6的溶藻方式

0-對照組;1-原菌液;2-無菌濾液;3-菌懸液;4-經高溫高壓處理后菌液;5-超聲破碎后菌液

圖4 溶藻菌WJ6的溶藻效果電鏡圖

圖(a)對照組藻細胞,圖(b)為實驗組藻細胞(標尺為1μm)

采用掃描電子顯微鏡對觀察溶藻菌WJ6作用后的銅綠微囊藻藻細胞的形態,如圖4所示,其中圖(a)為對照組藻細胞形態,圖(b)為實驗組藻細胞形態.對照組中藻細胞結構完整,經實驗組藻細胞結構被破壞,細胞形態發生變化,細胞內溶物釋放出來,致使細胞死亡.

2.4 溶藻特性研究

2.4.1 不同生長期的溶藻菌WJ6對銅綠微囊藻的溶藻效果 不同時期的菌株WJ6的溶藻效果如圖5所示,溶藻率最高的為對數期87.50%,穩定期的為83.33%,衰亡期的為79.17%,延滯期去除率最低為58.33%.對數期菌液的抑藻效果最好,可能是溶藻菌從延滯期后開始分泌具有抑藻效果的胞外物質而致.

圖5 不同生長期的溶藻菌WJ6的溶藻效果

2.4.2 不同濃度WJ6菌液對銅綠微囊藻的溶藻效果 不同菌液濃度對溶藻菌的溶藻效果如圖6所示.菌液濃度越大,溶藻效果越明顯,溶藻效果與菌液濃度在一定范圍內呈正相關關系.原菌液溶藻率最高為95.69%,10-6倍稀釋菌液溶藻率最低為52.59%.

圖6 不同濃度WJ6菌液的溶藻效果

2.4.3 環境因子對溶藻菌WJ6溶藻效果的影響 (1)不同培養基對溶藻菌WJ6溶藻效果的影響由圖7可知,改良的基本培養基培養的溶藻菌的溶藻率最高為98.50%,由BG11培養基培養的溶藻菌的溶藻率只有19.50%.牛肉膏蛋白胨液體培養基、查氏培養基和LB培養基培養的溶藻菌的溶藻率分別為96.00%、86.00%和80.00%.

圖7 不同培養基培養溶藻菌WJ6的溶藻率

1-牛肉膏蛋白胨液體培養基;2-BG11培養基;3-LB培養基;4-改良的基本培養基;5-查氏培養基

(2) 溫度對溶藻菌WJ6溶藻效果的影響 不同溫度對溶藻菌WJ6溶藻效果的影響如圖8所示,在30℃培養條件下,溶藻效果較好,溶藻菌的溶藻率為99.48%.25℃和20℃培養條件下,溶藻菌的溶藻率分別為94.55%、76.53%.

圖8 不同環境溫度下溶藻菌WJ6的溶藻率

(3) pH值對溶藻菌WJ6溶藻效果的影響 不同pH值對溶藻菌WJ6溶藻效果的影響如圖9所示,pH值分別調至5~9時,都具有溶藻作用,一定范圍內的pH值對溶藻效果的影響較穩定,溶藻菌WJ6對銅綠微囊藻的溶藻效果由強到弱順序為:pH8>pH7> pH9>pH6>pH5.當pH8時,溶藻菌的溶藻率為92.47%,當pH5時,溶藻菌的溶藻率為81.72%.

圖9 不同pH值時溶藻菌WJ6的溶藻率

(4) 銨離子和鹽度對溶藻菌WJ6溶藻效果的影響在培養基中加入不同濃度的NH4Cl,銨離子濃度對溶藻菌溶藻效果的影響如圖10所示.加入不同濃度的NH4Cl后,都有促進溶藻菌的溶藻作用.當銨離子濃度為1mol/L,溶藻菌的溶藻率達到71.67%.當銨離子濃度為3、4、5、6、7mol/L,溶藻菌的溶藻率最高為98.33%.

圖10 不同銨離子條件下溶藻菌WJ6的溶藻率

不同鹽度對溶藻菌溶藻效果的影響如圖11所示.一定濃度范圍的NaCl對溶藻菌溶藻有促進作用.溶藻菌溶藻效果的最適鹽度為0.5%,即原培養基,溶藻菌的溶藻率最高,為92.77%.當鹽度為0%,即培養基中不加NaCl時,溶藻率為24.10%.

圖11 不同鹽度條件下溶藻菌WJ6的溶藻率

3 討論

本研究從富營養湖泊水體中經富集、分離純化得到一株溶藻細菌WJ6.在菌株形態觀察和生理生化特征分析的基礎上,結合16S rDNA序列法對分離純化得到的溶藻細菌WJ6進行鑒定,初步鑒定該菌株屬于沙雷氏菌屬.目前已報道的溶藻細菌以革蘭氏陰性居多,本實驗篩選菌株WJ6為革蘭氏陰性菌,為溶藻方面報道較少的沙雷氏菌屬[18],并顯示出了良好的溶銅綠微囊藻的溶藻效果.溶藻率達到90%以上,為高效的溶藻細菌.廖春麗[19],黃現恩[20]等對分離到的溶藻細菌的溶藻專一性進行研究,其溶藻菌對富營養化水體中優勢藻如銅綠微囊藻,小球藻,柵藻及蛋白核小球藻等均有溶藻作用.張暉等[21]篩選到的高效抑藻菌C1138對3種不同藍藻均也有明顯的溶藻效果.

細菌溶藻方式一般有2種:直接溶藻與間接溶藻,直接溶藻即細菌直接進攻宿主,與藻細胞直接接觸,甚至侵入藻細胞內.間接溶藻指溶藻細菌同藻類競爭營養物質或分泌特異性或非特異性的胞外溶藻物質殺死藻類,如氨基酸、多肽、抗生素和蛋白質等等,其中分泌胞外溶藻物質是溶藻的主要方式.本實驗篩選的溶藻菌WJ6的菌懸液和無菌濾液均具有一定的溶藻效果,且無菌濾液的溶藻效果好于菌懸液溶藻效果,可以初步判斷該菌是直接溶藻與間接溶藻并存,主要為間接溶藻,即主要通過胞外釋放某種物質進行溶藻,且經高溫高壓處理后菌液得溶藻率較低,該菌溶藻物質可能為蛋白質類物質.程新等[22]篩選出的枯草芽孢桿菌也是通過分泌胞外物質實現的.張暉等[21]篩選的高效抑藻菌C1138主要是通過菌體與藍藻接觸而產生溶藻作用,也能通過分泌胞外物質產生溶藻作用,且部分溶藻物質熱穩定較差.張睿等[23]研究了枯草芽孢桿菌對銅綠微囊藻的抑制效果是通過分泌胞外物質實現的,且分泌物具有很強的熱穩定性.

溶藻菌的溶藻效果不僅與自身有關,與菌的濃度也有密切關系.Su等[24]研究溶藻菌的溶藻率與菌液濃度的關系,結果與本研究一致.黃晶晶等[25]從富營養化水體中分離出一株蘇云金芽孢桿菌MS7,研究了不同菌液濃度對溶藻效果的影響,結果表明在一定范圍內,溶藻菌菌液濃度越大,其溶藻率就越高.

4 結論

4.1 從富營養化水體中分離一株具有溶藻作用的菌株WJ6,為沙雷氏菌屬.

4.2 溶藻菌株WJ6以間接溶藻方式為主,且胞外分泌物熱穩定性差.

4.3 對數生長期溶藻菌株WJ6溶藻效果好,且原菌液的溶藻率最高,溫度為30℃、pH值為8時,溶藻效果較好.溶藻菌WJ6在改良的培養基中生長更促進其溶藻作用,當銨離子濃度較高、鹽度為0.5%時,溶藻菌WJ6溶藻高.

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Isolation and identification of an efficient algicidal bacteria strain and algicidal characteristics on.

HONG Gui-yun, MA Shao-xiong, WANG Jia, ZHANG Jin*

(Key Laboratory of Water Pollution Control and Waste Water Resource of Anhui Province, College of Environment and Energy Engineering, Anhui Jianzhu University, Hefei 230601, China)., 2018,38(11)：4269~4275

An algicidal bacteria strain with a strong algicidal effect towas isolated from the eutrophic water. Then, the algicidal bacteria was identified as WJ6 by analyzing it’s morphological features, physiological and biochemical characteristics, as well as phylogenetic analysis of 16S rDNA sequences. The algae-lysing means of WJ6 and the effects of different culture periods, concentrations of bacterium and environmental factors on the algae-lysing action were investigated to analyze the algicidal characteristics and possible algae-lysing mechanism of the strain WJ6. And the results showed that WJ6 was identified assp.(Accession No.KY462187). The algicidal mechanism of WJ6 is indirectively, which disolves the algae mainly by an extracellular products. At logarithmic growth phase, the strain WJ6 can dissolvewith a removal rate of 87.50%. The bacteria WJ6with on centration more than 1.4×109CFU/mL can give the highest removal rate of 95.69%. Under the condition of 30℃ and pH8, the removal rate is 90.00%. The effect of modified basic mediumon the algae-lysing effect of WJ6 is the most obvious with the higests removal rate of 98.50%. Furthermore, the removal rate of the algicidal bacterium is 98.33% when the ammonium ion concentration in the mediumis above 2mol/L. The removal rate is 92.77% when the salinity is 0.5%. All the results stated above indicate that the algicidal bacteria strain WJ6 have a strong algicidal effect toand prospective application in the control ofin eutrophic water.

algicidal bacteria；isolation and identification；；algicidal characteristics

X172,X524

A

1000-6923(2018)11-4269-07

洪桂云(1976-),女,安徽太湖人,副教授,博士,主要從事環境生物技術相關研究工作.發表論文20余篇.

2018-04-03

國家自然科學基金(21677001);安徽省自然科學基金(1708085MB50);省級大學生科技創新項目;校級教研項目(2017jy16, 2017kf02)

* 責任作者,副教授, ginnzy@163.com