新疆塔什庫爾干牦牛mtDNA Cytb基因和D-Loop區遺傳多樣性及系統進化分析

胡 丹，鐘金城*，柴志欣

(1.青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，西南民族大學 成都 610041；2.西南民族大學 青藏高原研究院，成都610041)

細胞色素b基因(Cytb)是哺乳動物線粒體DNA(mtDNA)上一個重要的功能基因，編碼線粒體氧化磷酸化復合體III蛋白質，該蛋白質由379個氨基酸組成[1]，因其基因功能限制，具有較強的保守性，插入和缺失的變異很少出現在Cytb基因中，大多數堿基置換集中在轉換和顛換兩種情況，因而Cytb基因經常被作為分析物種間遺傳進化關系的重要標記[2]，是最為理想的線粒體DNA遺傳標記之一[3-5]。近年來基于mtDNA的基因研究被廣泛應用于牦牛這一特殊物種上，姬秋梅等[6]通過對西藏牦牛Cytb基因的測序研究，系統闡述了西藏眾多牦牛類群的進化地位和種內遺傳多樣性；Cytb基因還被用于種間起源的研究當中，李齊發等[7]通過對野牦牛和家牦牛這兩個親緣關系較近的物種的線粒體基因研究，證實了家牦牛與野牦牛在遺傳進化關系上是由同一祖先進化而來的觀點；涂世英等[8]對中甸牦牛Cytb基因進行了測序，進一步證實了牦牛不同類群間存在巨大的基因多態性差異。而mtDNA中的D-loop區與Cytb不同，其進化速度快，變異較大，適用于對亞科內屬、種間的系統學研究，郭松長等[9]通過D-loop區部分序列的變異，對我國10個家牦牛品種間的遺傳多樣性、聚類關系進行了分析；張成福等[10]對西藏牦牛的D-loop區序列進行了測序，對其眾多類群的進化分類進行了不同角度的論證；汪琦等[11]測定了三江黃牛D-loop區部分序列對三江黃牛這一重要經濟品種的系統進化地位進行了闡述。

塔什庫爾干牦牛主要分布于我國新疆塔里木盆地西部、帕米爾高原東部、青藏高原北部邊緣及塔吉克斯坦東北部海拔2 900～4 700 m的高寒草原草場及高寒草甸草場，屬役、肉、乳、毛皮兼用型的原始地方牦牛類群[12-15]，體格粗壯結實，毛色以黑、灰居多，對環境適應性強、抗逆性好，是新疆帕米爾高原高寒地區農牧民賴以生存的重要畜種[5]。本研究測定了10個塔什庫爾干牦牛個體的Cytb基因和D-loop區序列，通過克隆測序探討了新疆西部高海拔地區這一新的牦牛類群的遺傳多樣性和mtDNA分子進化關系，為塔什庫爾干牦牛這一獨特遺傳資源的進一步保護與開發利用提供相應的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在新疆自治區塔什庫爾干自治縣塔合曼鄉采集健康成年牦牛耳組織樣品10個(75°54'12"E,32°0′36′′N，數據來源于國家基礎地理信息中心，http://ngcc.sbsm.gov.cn/)。耳樣于75%乙醇溶液中保存帶回實驗室-20 ℃低溫保存備用。

1.2 總DNA提取、引物合成與PCR擴增

使用動物組織基因組DNA提取試劑盒(TianGen)，提取牦牛耳樣DNA后產物分別進行瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測 DNA濃度和質量。

參考涂世英等[8]、楊萬遠等[16]對中甸牦牛和野牦牛Cytb基因設計的引物，其中F:5'-GTTCCGTAGCCATAGCCG-3'，R:5'-TTGAGTCTTAGGGAGGTT-3'，對塔什庫爾干牦牛細胞色素b基因進行擴增；參考郭松長等[9]對家牦牛D-loop區序列設計的引物，其中F:5'-CTGCAGTCTCACCATCAACC-3'，R:5'-GGGGTGTAGATGCTTGC-3'，對D-loop區序列進行擴增?？侾CR反應體系為25 μL，其中，上下游引物均為1 μL，模板DNA為1 μL，2×long Taq DNA預混酶12.5 μL，滅菌ddH2O 9.5 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性3.5 min；94 ℃變性45s；54 ℃退火50 s；72 ℃延伸1 min，35個循環；最后72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。

1.3 基因克隆及測序

PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段大小后進行膠回收，用DNA純化試劑盒分離純化后連接在PMD19-T載體上，將重組質粒轉化到高敏感度感受態細胞DH5中，再涂于LB平板(20g/L X-Gal,10g/L IPTG,10g/L Amp)上培養12 h后，挑取單一白色菌落接種在LB(10g/L Amp)液體培養基上震蕩培養8 h，重組質粒進行菌液PCR后由英濰捷基(上海)生物技術有限公司測序[11]。

1.4 對比序列來源

從Genebank獲得的牛亞科代表物種以及綿羊作為外群體的序列來源見表1。

表1 牛亞科代表性牛種及外類群序列來源Table 1 The source of sequences in part of Bovinae varieties and outgroup

1.5 數據處理

使用DNAMAN軟件對測序結果進行編輯整理；再使用clustalX1.83軟件對同源序列進行比較；使用DNAsp5.0軟件統計塔什庫爾干牦牛核苷酸多樣性(Nucleotide diversity)、單倍型多樣度(Haplotype diversity)和核苷酸單倍型數(Number of Haplotypes)，之后對突變位點進行Tajima's D中性檢驗；使用MEGA5.0軟件，自舉分析(Bootstrap)采用1000次重復抽樣，按照Kimura-Two-Parameter模型計算遺傳距離，NJ(Neighbor Joining Method)法構建進化樹。

2 結 果

2.1 Cytb基因與D-loop區PCR擴增

在普通牛mtDNA序列(Genebank Accession No.V00654)中，細胞色素b長度為1 140 bp，塔什庫爾干牦牛PCR擴增結果長度為1 650 bp左右(圖1)，與參考序列比對后，完全比對上的序列長度為1 140 bp，擴增出Cytb基因。參考普通牛mtDNA全序列得知D-loop區序列長度為898 bp，塔什庫爾干牦牛PCR擴增結果長度為 920 bp，將測序得到的序列與參考序列比對，完全比對上的長度在 890～910 bp之間，擴增出D-loop區序列。

2.2 塔什庫爾干牦牛mtDNA Cytb基因、D-loop區序列的遺傳多樣性

2.2.1 堿基序列組成 塔什庫爾干牦牛Cytb基因的全序列長度為1 140 bp，個體間序列長度無差異；T、A、G、C的含量分別為27.72%、33.21%、12.92%、26.15%；A+T含量為60.93%；G+C含量為39.07%，具有明顯的堿基偏好性。D-loop區序列全長在890～910 bp之間，不同個體間存在序列長度差異；4種核苷酸T、A、G、C的平均比例分別為26.12%、34.22%、25.27%、14.39%，；A+T含量為60.34%；G+C含量為39.66%，同樣存在明顯的堿基偏好性。

2.2.2Cytb基因和D-loop區序列的多態性 使用 DNAsp軟件計算塔什庫爾干牦牛Cytb基因序列的核苷酸多樣性(Nucleotide diversity)和單倍型多樣性(Hd)，發現3個SNP位點，全部為轉換，符合Cytb基因保守的特征；核苷酸多樣性(Pi)為0.00205，單倍型數(H)為3，其中Ta3～Ta10號樣本為一個單倍型， Ta2、Ta11號樣本各自為一個單倍型 (表2)，單倍型多樣性(Hd)為0.378；塔什庫爾干牦牛Cytb基因在581～1 026 bp之間有1個保守區域，在該保守區域內，A、T含量為58.1%；Tajima為-0.21 206，中性檢驗結果不顯著(P>0.10)。D-Loop區共統計出36個SNP位點，其中轉換11個，顛換21個，缺失3個，其核苷酸多樣性(Pi)為0.00 839，分析得到的單倍型數(H)為6，單倍型多樣性(Hd)為0.778，Tajima為-1.66 098，中性檢驗結果不顯著(P>0.05)。

2.3 遺傳距離及系統進化分析

選取美洲野牛、西藏牦牛等牛亞科代表性牛種及測序得到的塔什庫爾干牦牛，共15個牛種，以綿羊作為外類群用鄰接法(NJ)構建系統發育樹(圖2)。結果顯示塔什庫爾干牦牛首先與青海牦牛、巴州牦牛聚為一類，接著和西藏牦牛、野牦牛聚在一起，緊接著與美洲野牛聚在一起，普通牛、歐洲野牛和大額牛聚在一起后與牦牛一支聚在一起，而印度野牛與爪哇牛介于這兩支之間，牛亞科最外側為非洲水牛和亞洲水牛，犀牛、白犀牛、綿羊獨立于牛亞科物種之外?；贑ytb基因的牛亞種間遺傳距離見表3。由表3知，塔什庫爾干牦牛和巴州牦牛的遺傳距離最近為0.00115，其次是青海牦牛、西藏牦牛和野牦牛，分別為0.00345、0.00692和0.00808，最遠的是犀牛0.23185，牛種間距離最遠的是白犀牛和瓜哇牛，為0.24078。

選取麥洼牦牛、大通牦牛等牛亞科代表性牛種及測序得到的塔什庫爾干牦牛共14個牛種，同樣以綿羊作為外群體，NJ法構建系統進化樹(圖3)。在進化樹中，塔什庫爾干牦牛首先與麥洼牦牛和大通牦牛聚在一起，并與青海牦牛、巴州牦牛聚為一類，之后再與西藏牦牛和野牦牛聚為一類，之后和美洲野牛、歐洲野牛聚在一起，牛亞種群體中最外側為亞洲水牛，最后與綿羊聚在一起?；贒-loop區的牛亞種間遺傳距離見表4。由表4知，塔什庫爾干牦牛和麥洼牦牛的遺傳距離最近為0.00 148，其次是大通牦牛、巴州牦牛和青海牦牛，分別為0.00 471、0.00 994和0.00 808，最遠的是亞洲水牛0.15 199，牛種間距離最遠的是亞洲水牛和普通牛，為0.16 466。

表4 牛亞科不同物種間Kimura雙參數遺傳距離(D-loop)Table 4 Kimura 2-parameter genetic distance among species in Bovinae(D-loop)

3 討 論

本研究首次以塔什庫爾干牦牛線粒體基因為研究對象，測定了塔什庫爾干牦牛10個個體的Cytb基因與D-loop區全序列，對塔什庫爾干牦牛的遺傳多樣性與系統進化地位做出了進一步分析。經測定，Cytb基因序列總長度為1 140 bp，發現3個多態位點且變異類型全部為轉換，符合Cytb基因保守的特點； A、T、G、C四種堿基的含量百分比分別為27.72%、33.21%、12.92%、26.15%，表現出一定堿基偏好性；單倍型的多樣性為0.2 571，核苷酸多樣性為0.00 035。 D-loop區序列長度在不同個體間存在差異，長度在890～910 bp之間，4種核苷酸T、A、G、C的平均比例分別為26.12%、34.22%、25.27%、14.39%，同樣表現出一定的堿基偏好性。與Cytb基因不同的是，D-loop區進化速度快，變異較大的特性在本研究中也有所體現：本研究共統計出D-loop區序列中存在36個SNP位點，其中轉換11個，顛換21個，缺失3個，符合D-loop區序列的特征，也與汪琦等[11]對中甸牦牛D-loop區的研究結果相似；其單倍型多樣性(Hd)為0.778，核苷酸多樣性(Pi)為0.00 839，高于汪琦等[11]報道的中甸牦牛結果，表明塔什庫爾干牦牛種內具有豐富的遺傳多樣性，其群體變異也在中國地方牦牛類群中處于較高水平，同時，較高的單倍性多樣性及不均勻的核酸變異類型，說明塔什庫爾干牦牛群體內存在兩種母系起源的可能性較大，這也與家牦牛具有兩種母系起源的研究結果吻合[11，17]。

圖2 NJ法構建牛亞科系統發育樹(Cytb)Fig. 2 Neighborjoining tree reconstructed in Bovinae(Cytb)

圖3 NJ法構建牛亞科系統發育樹(D-loop)Fig. 3 Neighborjoining tree reconstructed in Bovinae(D-loop)

本研究基于Cytb基因的牛亞科系統聚類分析得出，塔什庫爾干牦牛與巴州牦牛、青海牦牛聚為一類，接著與西藏牦牛和野牦牛聚為一類，表明塔什庫爾干牦牛與巴州牦牛和青海牦牛親緣關系近，原因可能與塔什庫爾干牦牛和巴州牦牛在地理位置上較近，使得其基因交流的機會大大增加，也與其生存環境相似有關，而大部分巴州牦牛、青海牦牛與野牦牛親緣關系較近，與近年來人為育種改良存在必然聯系。在基于D-loop區序列的牛亞科系統聚類分析中，塔什庫爾干牦牛首先與麥洼牦牛和大通牦牛聚在一起，并與青海牦牛、巴州牦牛聚為一類，之后再與西藏牦牛和野牦牛聚為一類，與Cytb基因中與青海牦牛和巴州牦牛親緣關系近的推論不同的是，雖屬于同一分支，但塔什庫爾干牦牛與麥洼牦牛和青海大通牦牛的遺傳距離更近，之后才與巴州牦牛和青海牦牛聚在一起，這一結果也與D-loop區序列變異速度較快，樣本數量少有關，但也進一步說明了塔什庫爾干牦牛種內遺傳多樣性的豐富性。Cytb基因與D-loop區的聚類分析同時表明西藏牦牛與野牦牛單獨聚為一類，和其他牦牛類群分開，也符合現有的家牦牛與野牦牛是同一祖先原始牦牛后代的起源觀點[18-24]，塔什庫爾干牦牛在與巴州牦牛、青海牦牛和西藏牦牛的系統進化分析中表現出豐富的遺傳多樣性，進一步說明了這一新的牦牛類群在家畜遺傳資源的發掘過程中具有十分重要的現實意義。

4 結 論

本研究首次對塔什庫爾干牦牛10個個體的Cytb基因與D-loop區序列進行了完整的克隆測序分析，對其系統進化地位做出了闡述。塔什庫爾干牦牛具有作為我國地方優良地方牦牛品種的遺傳資源潛質，是寶貴的牦牛遺傳資源，其群體變異程度高，遺傳多樣性較為豐富，該結果可為塔什庫爾干牦牛遺傳資源的進一步保護與利用提供理論基礎。