香菇多糖提取工藝優化及其體外抗氧化活性

彭 浩， 吳 畏， 師艷秋， 王 賢， 宋文路

(1.濟寧學院生命科學與工程系，山東曲阜 273155； 2.山東凱斯達機械制造有限公司，山東濟寧 272000)

香菇[Lentinusedodes(Berk.) Sing]為擔子菌綱傘形科真菌，是世界上重要的食用菌兼藥用菌之一。人們將真菌多糖作為藥物進行研究始于20世紀50年代，在20世紀60年代以后，真菌多糖作為免疫促進劑受到廣泛關注，其中香菇多糖(lentinan，簡稱LNT)是研究得較為透徹的多糖之一[1]。LNT具有抗腫瘤[2]、抗病毒[3]、提高免疫力[4]、抗氧化[5]和刺激干擾素形成等功能，是一種重要的生理活性物質，因而被廣泛地應用于藥品、食品保健等行業中。

目前，關于LNT提取的研究較多。提取LNT的經典方法為水提醇沉法，該法成本低廉、易于操作、工藝簡明。但是，熱水浸提法采用的浸提溫度為70～80 ℃，耗能多，提取時間長，提取率低。另一類常見的提取方法為酸法、堿法，但提取過程不容易控制反應條件，且酸堿濃度過高時會有腐蝕性，多糖結構極可能遭到破壞，導致香菇多糖分子量下降，造成其生物活性的降低。目前，多種新技術如超聲波輔助提取、微波輔助提取、酶法輔助提取、半仿生提取的使用在一定程度上彌補了傳統工藝的缺陷[6-7]。其中，微波預處理-超聲波提取法[8]能較好地結合微波提取法和超聲波提取法兩者的優點，利用微波的熱效應(內加熱)使原料的細胞壁和細胞膜迅速溶脹破裂，再利用超聲波的空化效應和機械效應使溶劑快速滲入細胞內部，從而使有效成分迅速溶解并快速離開細胞膜和細胞壁，進入主體溶劑。微波預處理-超聲波提取法既能快速高效地提取物料中的有效成分，也能避免微波作用時間過長而引發的不良效果，確保有效成分最大限度地被提取，是一種極具發展潛力的新型提取技術[5]。

目前已有關于微波預處理-超聲波提取山茱萸多糖及其穩定性研究的報道[9]，也有關于經微波預處理-超聲波提取的LNT抗氧化活性的研究[5]，且后者在固定微波和超聲波功率條件下對微波時間等條件進行了優化。本研究以香菇多糖提取率為指標，在微波功率為250 W、時間為30s的固定預處理條件下，通過對料液比、超聲功率、超聲溫度、超聲時間4個因素進行單因素試驗和正交試驗，優化提取工藝條件，并研究經本工藝條件提取的LNT的抗氧化活性，以期為LNT的新型提取工藝研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇：品種為黑面菇，產于浙江省，市售。所使用試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設備

JA12002電子天平，上海精密科學儀器有限公司；GBSY-4電熱恒溫水浴鍋，北京醫療設備廠有限責任公司；TGL-16B臺式高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；RE-52多用途旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；TU-1900紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；DHG9070電熱鼓風干燥箱，濟寧市精宏儀器有限公司；FS30C 攪拌粉碎機，廣州雷邁機械設備有限公司；KQ-250DE超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；WD7007L23-K5微波爐，廣東格蘭仕電器銷售有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取工藝流程 香菇洗凈烘干→粉碎→水溶→微波預處理→超聲波處理→過濾→上清液蒸發濃縮→乙醇沉淀→離心→在沉淀中加木瓜蛋白酶→離心→上清液二次醇沉→靜置過夜→無水乙醇洗滌→稀釋粗多糖提取液→測定。

1.3.2 操作要點 將香菇洗凈，置于電熱鼓風干燥箱中，于80 ℃烘干至恒質量，用攪拌粉碎機粉碎，過40目篩。將制成的香菇粉置于棕色瓶內密封保存備用。稱取1.0 g香菇粉置于錐形瓶中，加入蒸餾水溶解。用微波(功率為250 W)預處理30 s后，在超聲波清洗器中按照既定條件進行超聲波處理，處理后將溶液于4 000 r/min離心10 min，將上清液用旋轉蒸發儀蒸發濃縮至一定體積后，加入3倍體積的無水乙醇，在 4 ℃ 條件下靜置過夜。將提取液于4 000 r/min離心 20 min。加入蒸餾水溶解沉淀，加入1%～2%木瓜蛋白酶，以稀HCl調節pH值為8.0，于55 ℃水浴中放置2 h。除蛋白后于 4 000 r/min 離心20 min；在上清液中加入4倍體積的無水乙醇沉淀，于4 ℃靜置過夜。于4 000 r/min離心收集沉淀，用無水乙醇洗滌，即得LNT。稀釋粗多糖提取液，測定多糖提取率。

1.3.3 LNT提取率的測定 多糖提取率的測定采用改進的苯酚-硫酸法[10]。以葡萄糖作為標準品，精確配制濃度為0.1 mg/mL的標準溶液。依次量取0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL標準溶液，用蒸餾水定容至1.0 mL。加入0.5 mL 6%苯酚、2.5 mL濃H2SO4，搖勻，沸水浴20min，室溫放置20 min，于490 nm處測吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標、D490 nm為縱坐標繪制標準曲線。

根據葡萄糖標準曲線制作方法測定吸光度，根據式(1)計算多糖提取率：

(1)

式中：C為根據標準曲線求得的多糖濃度，g/mL；V為樣品溶液的定容體積，mL；D為LNT的稀釋倍數；m為香菇原料質量，g。

1.3.4 單因素試驗設計 影響LNT提取率的因素較多，如料液比、提取溫度和時間、提取次數、pH值等。以微波法作為樣品的預處理方法，單因素試驗設計如下：

(1)料液比。取在不同料液比下經微波預處理后的香菇溶液，在超聲波提取功率為60 W、超聲波提取溫度為40 ℃、超聲波提取時間為15 min的條件下，考察不同料液比(1 g ∶10 mL、1 g ∶20 mL、1 g ∶30 mL、1 g ∶40 mL、1 g ∶50 mL)對LNT提取率的影響。

(2)超聲波提取溫度。將料液比設為1 g ∶30 mL，在微波預處理后的香菇溶液超聲波提取功率為60 W、超聲波提取時間為15 min的條件下，研究不同超聲波提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)對LNT提取率的影響。

(3)超聲波提取時間。將料液比設為1 g ∶30 mL，在微波預處理后的香菇溶液超聲波提取功率為60 W、超聲波提取溫度為40 ℃的條件下，考察不同超聲波提取時間(10、15、20、25、30 min)對LNT提取率的影響。

(4)超聲波提取功率。將料液比設為1 g ∶30 mL，在微波預處理后的香菇溶液超聲波提取溫度為40 ℃、超聲波提取時間為15 min的條件下，考察不同超聲波提取功率(60、70、80、90、100 W)對LNT提取率的影響。

1.3.5 正交試驗設計 根據單因素試驗的結果，選取料液比、超聲時間、超聲溫度、超聲功率4個因素的各3個適宜水平，按照L9(34)進行正交試驗，優化提取工藝，確定最佳提取工藝條件，因素水平設計見表1。

1.3.6 LNT的抗氧化活性分析

1.3.6.1 總抗氧化能力的測定 采用鐵離子還原/抗氧化能力(FRAP)法測定總抗氧化能力[11-12]。取1 mL不同質量濃度的LNT水溶液進行試驗，空白組用去離子水代替，對照組用同等質量濃度的維生素C代替，每個樣品重復測定3次。以1.0 mmol/L FeSO4溶液為標準物繪制標準曲線，樣品抗氧化活性以達到同樣吸光度所需的FeSO4濃度(μmol/L)表示，即為FRAP值。

表1 4因素3水平正交試驗因素水平

1.3.6.2 DPPH自由基清除能力的測定 參考李亞輝等的方法測定DPPH自由基清除能力[12-13]。取1 mL不同質量濃度的LNT水溶液，在517 nm波長處測吸光度，空白組用水代替樣品，對照組用同等質量濃度的維生素C代替，每個樣品重復測定3次。相關公式如下：

(2)

式中：D1為樣品組的吸光度；D0為對照組的吸光度。

1.3.6.3 羥自由基清除能力的測定 采用2-脫氧核糖法測定羥自由基清除能力[12，14]。取500 μL不同質量濃度的LNT水溶液進行試驗，在510 nm波長處測吸光度，空白組用水代替樣品，對照組用同等質量濃度的維生素C代替，每個樣品重復3次。相關公式如下：

(3)

式中：D1為樣品組的吸光度；D0為空白組的吸光度。

1.3.7 數據分析 試驗結果以平均值±標準偏差表示。采用Excel 2007和SPSS 19.0分析軟件進行方差分析和t檢驗。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖溶液標準曲線

以葡萄糖濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標作圖，繪制葡萄糖標準曲線?；貧w方程為y= 6.536x+0.04，r2=0.99(圖1)。式中：y為吸光度；x為質量濃度(mg/mL)。由圖1可見，該法的標準曲線在0.01～0.1 mg/mL范圍內能很好地符合線性要求，可以用來進行LNT含量測定。

2.2 單因素研究

2.2.1 料液比對LNT提取率的影響 由圖2可知，在料液比為1 g ∶10 mL～1 g ∶30mL的范圍內，LNT提取率隨著料液比提高而顯著增加。在料液比為1 g ∶30 mL～1 g ∶50 mL的范圍內，隨著料液比的提高，提取率反而降低。在LNT提取過程中，水起到超聲波介質的作用。溶劑用量較少時，原料細胞組織浸潤不完全，使得提取效果較差。隨著料液比的提高，溶劑量增大，從而使超聲波的介質增多，降低了多糖物質向外擴散的阻力，進而使LNT提取率不斷提高[15]。然而，過多的溶劑會消耗大量超聲波輻射能量，進而影響多糖的析出[9]。當料液比為1 g ∶30 mL時，多糖提取率最高，為5.35%。因此可見，在單因素條件下，1 g ∶30 mL為最佳料液比。

2.2.2 超聲波提取溫度對LNT提取率的影響 由圖3可知，香菇多糖的提取率首先隨著超聲提取溫度的增加而提高，當提取溫度為60 ℃時，多糖提取率最高，可達5.68%；當提取溫度為70 ℃時，多糖提取率顯著降低。溫度過高可能使多糖溶液黏度增加，且使部分多糖結構遭到破壞，從而使其提取率降低。因此可見，在單因素條件下，60 ℃為最佳超聲提取溫度。

2.2.3 超聲波提取時間對LNT提取率的影響 由圖4可知，當超聲波提取時間為10～20 min時，隨著提取時間的延長，LNT提取率顯著提高；當超聲時間為20 min時，多糖提取率最高，為5.73%；當提取時間超過20 min后，多糖提取率開始下降。這說明多糖提取過程與超聲波處理時間密切相關，超聲波處理時間短，多糖溶出得不充分；超聲處理時間過長，產生較強的機械剪切作用，使組織中的大量細胞進一步破裂，從而使細胞內大量不溶物及黏性物質等混入提取液中，溶液中雜質增多，黏度增大，從而增大了傳質阻力，影響了多糖成分的溶出。另一方面，可能是隨著超聲提取時間的延長，超聲波較強的空化和機械振動使部分多糖大分子鏈斷裂，其小分子的糖在醇沉處理過程中損失了，從而降低了多糖的提取率[16]。因此可見，在單因素條件下，20min為最佳超聲提取時間。

2.2.4 超聲波提取功率對LNT提取率的影響 由圖5可知，在60～70 W的超聲功率范圍內，隨著超聲功率的增加，LNT的提取率也在提高，當超聲功率為70 W時，多糖提取率最高，為6.25%。原因可能是隨著超聲功率的增加，超聲空化效應、高速射流以及機械剪切的攪拌作用等加強，有效地減少了水與粉末間的阻滯，使細胞得到更加充分的破裂，從而加速了細胞中多糖分子在水中的溶出。當功率超過70 W時，LNT的提取率開始下降。這可能是由于大功率的物理剪切作用及其引起的局部溶液瞬時升溫過熱，造成部分多糖分子鏈的斷裂而降解，使多糖糖苷鍵被打斷，多糖結構被破壞，在后處理中造成了損失，從而使多糖提取率降低[17]。因此可見，在單因素條件下，超聲波提取功率應以70 W為宜。

2.3 LNT微波預處理超聲波提取法最佳條件的確定

2.3.1 正交試驗結果 由表2可以看出，RD>RB>RC>RA，可知超聲波功率的變化對多糖提取率的影響最明顯，進一步說明超聲波在該提取方法中的重要作用。其他對多糖提取率影響較大的因素依次為超聲時間、超聲溫度、料液比。由k值得到最優水平為A3B2C2D3。

表2 正交試驗結果

2.3.2 LNT提取率方差分析 為了進一步確定微波預處理超聲波法提取LNT的最佳工藝條件，對試驗誤差試驗條件對試驗結果的影響進行評估和判斷，用SPSS 19.0軟件進行方差分析。由表3可知，料液比、超聲時間、超聲溫度以及超聲功率都會影響多糖的提取率，其中超聲時間、超聲溫度以及超聲功率3個因素的影響均達到顯著水平(P<0.05)。由于料液比對于提取率的影響并不顯著，對試驗結果和數據的影響不大，本著高效節約的原則，確定A2為A因素的最佳水平。綜合以上分析，確定最佳工藝條件組合為A2B2C2D3，即料液比為1 g ∶20 mL、超聲波處理時間為20 min、超聲溫度為 60 ℃、超聲功率為80 W。

表3 方差分析結果

注：“*”表示差異顯著(P<0.05)。

2.3.3 驗證試驗 對通過正交試驗得出的最佳工藝條件進行最優化驗證試驗，結果表明，3次平行試驗的平均提取率為7.16%，明顯高于其他條件下的LNT提取率。

2.4 LNT的體外抗氧化性分析

2.4.1 LNT的總抗氧化能力 由圖6可知，LNT的總抗氧化能力隨著其質量濃度的增加而逐漸增強，當LNT質量濃度為 25 mg/mL 時，其總抗氧化能力約達到95.39 μmol/L，說明所提取的LNT具有一定的總抗氧化能力。但與相同質量濃度的維生素C相比，LNT的FRAP值較小，說明LNT的總抗氧化能力略低。

2.4.2 LNT對DPPH自由基的清除能力 由圖7可知，當LNT質量濃度為0～25 mg/mL時，LNT對DPPH自由基的清除率隨著樣品質量濃度的升高而提高。當質量濃度為 25 mg/mL 時，其DPPH自由基清除率達到76.22%。與相同質量濃度的維生素C標準品相比，LNT對DPPH自由基的清除率略大，說明LNT具有較強的DPPH自由基清除能力。

2.4.3 LNT對羥自由基的清除能力 由圖8可知，當LNT質量濃度為0～15 mg/mL時，其對羥自由基的清除能力增加得較快；當LNT質量濃度為15～25 mg/mL時，其對羥自由基的清除能力增加得較慢；當LNT質量濃度為25 mg/mL時，對羥自由基的清除率達最大值，為92.41%。LNT對羥自由基的清除效果略高于同質量濃度的維生素C，說明所提取的LNT具有較強的羥自由基清除能力。

3 結論

本研究工藝采用微波預處理-超聲波輔助法提取香菇多糖，得到其最優化工藝條件：微波功率為250 W，預處理時間為30 s，料液比為1 g ∶20 mL，超聲功率為80 W，溫度為 60 ℃，超聲時間為20 min。在此優化條件下，LNT提取率為7.16%，明顯高于目前常見新技術的提取率，如超聲波輔助提取法(6.47%)[18]、微波輔助提取法(6.49%)[19]、超聲波與酶協同提取法(6.94%)[15]。本工藝過程使用的微波與超聲波功率較低，無加熱等其他工藝，極大地降低了能源消耗，且提取的LNT具有良好的體外抗氧化活性。由此可見，LNT的微波預處理-超聲波輔助提取工藝既對節能環保提供了很好的思路，也可為LNT的工業化生產提供理論依據。