峨眉薔薇Ro-DREB1C的克隆與生物信息學分析

周寧寧，王俊云，李淑斌，陳 敏，張 顥，王其剛*

(1.云南省農業科學院花卉研究所，云南昆明 650200;2.國家觀賞園藝工程技術研究中心，云南昆明 650200;3.云南省花卉技術培訓推廣中心，云南昆明 650000)

【研究意義】豐富耐寒性狀相關的月季CBF基因的基礎數據庫?！厩叭搜芯窟M展】植物在經受非冰凍低溫脅迫后，其抵御低溫迫害的能力會得到提高，這一現象稱為低溫馴化［1］。在低溫馴化過程中，通過信號轉導途徑激活相應轉錄因子與作用元件特異結合，調節下游抗逆基因的表達，可提高植物對低溫脅迫的抗性［2］。DREB亞家族成員隸屬于AP2/ERF家族，分為6個亞組(A-1亞組至A-6亞組)，其中A-1亞組成員在植物低溫應答過程中起著關鍵調控作用［3］。模式植物擬南芥基因組中A-1亞組含有4個DREB1/CBF和2個 DDF轉錄因子［4］，其中CBF1、CBF2及CBF3在冷脅迫下能夠被快速誘導激活［5］，調控下游100多個基因的表達，同時CBFs之間又相互調控，致使其低溫調控網絡非常復雜［6］。近年來，DREB1/CBF轉錄因子在月季中的功能研究取得了一定的進展，如翟俊峰［7］等利用熒光定量PCR分析RhCBF在不同逆境脅迫下的表達情況，結果顯示低溫和鹽脅迫均可以誘導Rh-CBF的表達，而干旱脅迫不能誘導其表達。王婷等［8］用半定量RT-PCR分析結果表明，Rh-DREB1A和Rh-DREB1B在月季花瓣中能夠被失水脅迫強烈誘導，但是不受乙烯誘導。Chen等從苜蓿中克隆得到MtDREB1C基因，并分別在苜蓿(Medicago truncatula)和月季花(Rosa Chinensis Jacq.)植株中進行了功能驗證，研究表明在苜蓿中過量表達MtDREB1C會抑制新梢生長和提高植株的耐寒能力，而將Mt-DREB1C轉到月季中表現為轉基因植株的耐寒力增強，且不會造成植株的畸形生長［9］。隨后，Chen等利用MtDREB1C基因和RcXET基因構建了共表達載體，獲得MtDREB1C和RcXET共表達的轉基因月季植株，研究表明該轉基因植株具有更強的耐寒和耐旱能力［10］?！颈狙芯壳腥朦c】項目組前期結合野生資源原生地生境及植株生長情況的調查和冬季栽培的田間表現，選擇了10個野生種，對其低溫脅迫下葉片相對電導率、脯氨酸、丙二醛、可溶性糖及可溶性蛋白的含量進行了測定。研究表明10個野生種中，峨眉薔薇原變種的耐寒性最強［11－12］?！緮M解決的關鍵問題】本研究以峨眉薔薇原變種為材料，克隆獲得了與耐寒相關的轉錄因子Ro-DREB1C，借助相關生物信息學軟件，分析該基因編碼的氨基酸序列結構，對其蛋白質的理化性質、二級、三級結構等進行預測，并對Ro-DREB1C在擬南芥AP2基因家族各亞組基因成員中構建進化樹，明確 Ro-DREB1C與其他月季CBF基因的關系，及其所隸屬的基因家族，以期為后續月季DREB亞家族成員的功能研究奠定相應基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

峨眉薔薇引種于昆明轎子雪山(北緯26°08'44″、東經 102°08'46″)，海拔 2300 m［13］，現種植于云南省農業科學院花卉研究所國家觀賞園藝工程技術研究中心野生薔薇資源圃。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒EasyPure Plant RNA Kit(ER301)、RNA反轉錄試劑盒 TransScript II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Supermix、反轉錄引物 Anchored Oligo(dT)20Primer和 Random Primer(N9)、RNase-free Water、TransStart TopTaq DNA Polymerase(AP151)、克隆載體pEASY-T5 Zero Cloning Kit(CT501)等，購于北京全式金生物技術有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 峨眉薔薇 cDNA的制備 按照 EasyPure Plant RNA Kit(ER301)說明書所示，提取峨眉薔薇嫩莖組織 RNA，并用30 μl RNase-free Water洗脫。用1.5%的瓊脂糖凝膠和Bio Drop Lite PC超微量可見-紫外分光光度計檢測RNA質量和濃度。然后根據TransScript One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒操作要求，分別利用引物Anchored Oligo(dT)20Primer和Random Primer(N9)反轉錄成2種cDNA后于－20℃保存備用。

1.3.2 Ro-DREB1C基因的克隆 根據GenBank中檢索到的月季品種‘寒錦4號’RhCBF基因序列，利用Primer5.0軟件設計上下游特異引物，盡量避免選擇形成發夾結構與二聚體的引物，GC含量不超過46%，預計擴增大小為600～700 bp。引物序列:上游，5'-TATAAATCCCCATGCTCT-3';下游，5'-GGTCAACAATCCAAGTCA-3'。擴增引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

利用設計的上下游引物，以反轉錄得到的2種cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系50 μl:cDNA 模 板 3 μl，上 下 游 引 物 各 1 μl，TransStart TopTaq DNA Polymerase 1 μl，dNTP(2.5 mM)5 μl，ddH2O 39 μl。PCR反應程序:95℃預變性5 min，(95℃變性30s+45℃復性30s+72℃延伸60s)×40個循環，最后72℃延伸5 min，4℃保存。PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

選擇擴增效果較好的PCR產物4 μl和pEASYT5 Zero載體1 μl，PCR 儀中25 ℃連接30 min。連接產物全部轉化Trans1-T1感受態細胞中，42℃熱激30 s，冰上靜置2 min，加入400 μl SOC 培養基中，37℃ 200 r/min搖菌1 h。搖好的菌液4 000 r/min離心1 min后棄上清，取100 μl涂于含氨芐青霉素(Amp+)抗性的LB平板上，37℃過夜培養。從平板上隨機挑取白色單菌落，使用上下游引物進行菌落PCR鑒定，取PCR鑒定合格的菌懸液，加入1 mL含氨芐青霉素抗性的LB培養基中，37℃ 200 r/min搖菌過夜。次日送Invitrogen公司測序。

1.3.3 生物信息學分析 利用 Geneious 5.3.6軟件對克隆的Ro-DREB1C全長序列進行基因注釋，并對Ro-DREB1C和RhCBF進行序列比對分析;使用NCBI的 CD-search 工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)搜索氨基酸保守結構域;選用MEGA7軟件構建系統進化樹;使用Prot-Param(http://web.expasy.org/protparam/)、Predict-Protein(http://www.predictprotein.org)、SWISSMODEL(http://swissmodel.expasy.org/)、Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～ phyre2/html/page.cgi?id=index)TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)、SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)等在線軟件分析Ro-DREB1C蛋白的一級結構(理化性質)、信號肽及亞細胞定位、二級結構、三級結構預測［14］。

2 結果與分析

2.1 峨眉薔薇總RNA質量檢測

從峨眉薔薇嫩莖組織提取的RNA用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，點樣孔無異物、下部無DNA條帶，表明該樣品無蛋白質和DNA污染;得到帶形完整的3條帶，分別為28S、18S和5S rRNA，RNA完整性較好(圖1)。紫外分光光度儀測定RNA濃度，以備后面實驗所需。

2.2 峨眉薔薇Ro-DREB1C基因目標片段的擴增與TA克隆

1～4號樣本是以引物Anchored Oligo(dT)20反轉錄得到的cDNA為模板擴增的PCR產物，5～8號是以引物Random Primer(N9)反轉錄得到的cDNA為模板擴增得到的PCR產物。結果如圖2左所示:1號和6號樣本在600～750 bp擴增得到相同大小的條帶。選擇條帶較亮的6號PCR產物進行載體構建，培養得到了理想的白色菌落。

圖1 峨眉薔薇嫩莖組織總RNA(5 μl)電泳圖Fig.1 Electrophoresis of total RNA(5 μl)from young stem tissue in R.omeiensis Rolfe f.omeiensis

從平板上隨機挑取了10個單菌落，進行PCR擴增，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，Trans2K Plus Π DNA Marker和菌落PCR產物點樣量均為5 μl。結果如圖2右所示:7號樣本在650～800 bp擴增到一條明顯的片段，與預擴增片段大小一致，切膠回收條帶清晰、效果良好，可用于測序。

2.3 Ro-DREB1C 序列分析

利用 Geneious5.6.3軟件分析 Ro-DREB1C基因，包含一個長度為603 bp的開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，編碼200個氨基酸，數據已提交至 GenBank(登錄號:KX397104)。Ro-DREB1C與RhCBF基因編碼區的序列比對顯示:2個基因編碼區堿基序列相似度(Pairwise Identity)為96.5%，氨基酸序列相似度為95%，共檢查到21個潛在SNP，其中8個為潛在同義SNP位點，13個為潛在非同義SNP位點，共導致10個差異氨基酸。

2.4 Ro-DREB1C蛋白的理化性質及一級結構分析

用ProtParam軟件預測Ro-DREB1C蛋白質的理化性質。結果顯示:此蛋白質分子式為C968H1539N263O299S11，分子量 21 998.1D，理論等電點(pI)為6.75，說明該蛋白為弱酸性蛋白質;氨基酸殘基中絲氨酸 Ser(11.5%)、亮氨酸 Leu(11.0%)及丙氨酸Ala(9.5%)的頻率較高(圖4)，正負電荷氨基酸殘基數均為24;消光系數(M-1 cm-1 γ=280 nm)為29 575，其不穩定系數為53.88，大于40，屬不穩定類蛋白質［15］。疏水指數為75.65，平均親水性為 －0.354，屬可溶性蛋白［16］。

圖2 以cDNA為模板的PCR產物(左)和菌落PCR產物(右)電泳圖Fig.2 Electrophoresis for PCR amplified fragment of cDNA template(left)and PCR amplified fragment of colony(right)

圖3 Ro-DREB1C和RhCBF的序列比對圖Fig.3 Sequence alignment between Ro-DREB1C and RhCBF

用ProtScale程序繪制Ro-DREB1C蛋白質的親疏水性序列譜，窗口大小使用默認值9，圖形輸出顯示(圖5):該蛋白質存在4個高分值，分別分布在30、102、134、174氨基酸位點附近;而5個低分值峰值位于 17、47、120、152、183 氨基酸位點附近，這些區域屬于親水性。從ProtScale預測文本結果顯示，疏水性氨基酸(Score＞0)占38%，親水性氨基酸(Score＜0)占62%。

2.5 Ro-DREB1C亞細胞定位預測

利用PSORT II Prediction軟件對Ro-DREB1C的亞細胞定位進行預測分析，結果顯示，Ro-DREB1C在細胞核、線粒體、細胞質、細胞骨架和高爾基體的分布比例分別為 47.8%、21.7%、17.4%、8.7%和4.3%，在細胞核中的分布最多。利用TMHMM和TMpred在線工具對Ro-DREB1C蛋白進行跨膜區分析，結果均顯示該蛋白無跨膜區。通過SignalP在線工具對信號肽分析顯示，該基因編碼的蛋白質無信號肽序列存在。

2.6 Ro-DREB1C二、三級結構分析

對蛋白質二級結構的預測分析有助于認識蛋白的空間結構。選擇 PredictProtein軟件預測 Ro-DREB1C 的二級結構，表明:α-螺旋占19.5%，β-折疊占9%，無規卷曲占71.5%。由于無規則卷曲所占比例超過50%，此蛋白不能被歸入明確的二級結構如折疊片或螺旋的多肽區段［17］。

圖4 氨基酸組成Fig.4 Amino acid composition

運用CD-search工具分析Ro-DREB1C基因編碼蛋白的保守結構域(圖6)，分析認為該蛋白屬于乙烯反應元件結合蛋白AP2/EREBP(ethylene responsive element binding protein)，具有一個由61個氨基酸殘基組成的DNA結合域，可與啟動子區域中的GCC box特異結合。

結合同源建模軟件SWISS-MODEL和線串法(Threading)Phyre2在線軟件對Ro-DREB1C蛋白質綜合建模，由建模輸出的數據可知:同源建模軟件SWISS-MODEL 在線搜索到模板1gcc.1.1，該模板和預測序列相似度為43%，建模位點范圍59～118，覆蓋率0.3，GMQE 值 0.19，偏低，代表此模型可信度低;線串法建模軟件 Phyre2在線搜索模型為d1gcca，模板和預測序列相似度為52.4%，建模位點范圍59～119，覆蓋度30.5%，可信度(confidence值)為99.9%。綜上所述，最終選用線串法分析結果，模型如圖7。

圖5 Ro-DREB1C氨基酸序列的疏/親水性預測Fig.5 Predicted hydrophobicity/hydrophily of the deduced amino acid sequence of Ro-DREB1C

圖6 Ro-DREB1C蛋白質結構域分析Fig.6 Analysis of conserved domain of Ro-DREB1C protein

圖7 Ro-DREB1C的三級結構預測建模Fig.7 The tertiary structure of Ro-DREB1C by Phyre2

圖8 月季CBF/DREB1蛋白相對于擬南芥DREB亞家族的進化分析Fig.8 Phylogenetic analysis of Ro-DREB1C among DREB subfamily in Arabidopsis thaliana

2.7 Ro-DREB1C的同源性分析

在擬南芥基因組數據庫中(https://www.arabidopsis.org/)，利用 BLAST 工具，對 Ro-DREB1C 的氨基酸序列進行BlastP分析，結果發現:匹配度最高的基因為DREB亞家族的CBF1/DREB1B和CBF2/DREB1C，Socre(bits)為120，E value分別為4×e－28、7×e－28。根據BlastP的搜索結果，選擇了A-1亞組(CBF1、CBF2、CBF3、CBF4、DDF1、DDF2)和 A-2 亞 組 (AT3G11020、AT5G05410、AT1G75490、AT2G40340、AT2G40350)、A-4 亞組(AT2G36450、AT5G52020、AT1G01250、AT3G16280、AT5G25810)、A-5 壓組 (AT4G06746、AT2G23340、AT4G36900、AT3G50260、AT5G67190)、A-6 亞組(AT1G22190、AT1G78080、AT1G36060、AT1G64380、AT4G13620)。此外，還選取了已在月季中進行誘導表達或轉基因功能驗證的基因 RhCBF［7］、Rh-DREB1A 和 Rh-DREB1B［8］、MtDREB1C［9］。利用 MEGA7 軟件，選擇鄰位連接法(neighbor-joining，NJ)，對以上31個基因構建進化樹(如圖8)。結果表明:擬南芥的各亞組成員分別聚為一類;Ro-DREB1C、Rh-DREB1A、Rh-DREB1B、RhCBF和MtDREB1C與擬南芥 A-1亞組成員聚為一類;A-1亞組中，Ro-DREB1C與RhCBF為同一個基因聚類在一起，Rh-DREB1A、Rh-DREB1B和MtDREB1C與擬南芥的DDF基因聚類在一起。

3 討論

有效鑒定和利用野生種質資源的優良基因或等位基因，通過優良等位基因的累積提高植物育種的遺傳增益，是現代分子育種的熱點［18］。本研究利用克隆技術得到Ro-DREB1C基因，其同源性分析表明Ro-DREB1C屬于AP2家族DREB亞家族中的A-1亞組成員。擬南芥A-1亞組共有6個基因，薔薇或月季中A-1亞組的基因數還未知。分別對Rh-DREB1A、Rh-DREB1B、Ro-DREB1C 氨基酸序列進行比對，結果表明這3個基因之間的氨基酸序列相似度較低，在40% ～55%，結合系統發育樹(圖8)的結果，推測Ro-DREB1C、Rh-DREB1A、Rh-DREB1B 為旁系同源，故將從峨眉薔薇克隆得到的DREB基因命名為Ro-DREB1C(‘Ro’為種的拉丁名縮寫)。野生的峨眉薔薇Ro-DREB1C與現代月季品種的Rh-CBF為直系同源，其CDS區的序列比對發現了21個SNP位點，無堿基的缺失或插入。其中有10個A/G、4個T/C之間發生轉換(transition)，3個A/C、2個A/T、1個G/C、1個C/T之間的顛換(transversion)。前人研究結果指出:從理論上分析，若單個堿基突變是隨機的，則SNP位點中顛換所占比例應為轉換的2倍，但實際上SNP位點的產生多由單個堿基的轉換所引起［19］，本研究的結果與此相符?，F代月季品種形成過程中主要參與的野生種有8～10個［20］，峨眉薔薇不在其中，而Ro-DREB1C和RhCBF編碼區存在豐富的單核苷酸多樣性(SNP)，說明峨眉薔薇與現代月季品種間具有豐富的遺傳多樣性，因此認為峨眉薔薇可作為月季耐寒育種材料進行保存利用。

通過生物信息學分析軟件對Ro-DREB1C蛋白質進行結構分析，推測該蛋白質為弱酸性、不穩定類、親水性蛋白，二級結構主要由無規則卷曲和α-螺旋構成，β-折疊散布于其中，與擬南芥CBF2分析結果一致［21］。

4 結論

克隆了峨眉薔薇的一個CBF基因命名為Ro-DREB1C，分析了該基因編碼蛋白的理化性質和二三級結構，確認了隸屬于AP2家族DREB亞家族A-1亞組成員。此外，野生的峨眉薔薇Ro-DREB1C與現代月季品種的RhCBF比較，編碼區存在豐富的單核苷酸多態性(SNP)，可作為優秀的月季耐寒育種材料加以保存和利用。