甘蔗轉化酶抑制子SoInvInh2基因克隆和表達分析

?？∑?，黃金容，苗小榮，王道波* ，楊麗濤 ，李楊瑞

(1.玉林師范學院生物與制藥學院，廣西玉林 537000;2.廣西農產資源化學與生物技術重點實驗室，廣西玉林 537000;3.廣西大學農學院/亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西南寧 530005;4.中國農業科學院甘蔗研究中心/廣西農業科學院甘蔗研究所，廣西南寧 530007)

【研究意義】甘蔗是我國重要的糖料作物，也是廣西的支柱經濟作物。全球60%的食糖來源于甘蔗，而我國甘蔗糖產量占全國食糖總產量的比例高達90%以上［1］。蔗糖分是衡量甘蔗品種優劣的最重要指標之一，探討甘蔗體內與蔗糖代謝相關酶的酶活水平、消長規律和基因的遺傳多樣性，可為選育高糖甘蔗品種奠定理論基礎。蔗糖轉運及其在蔗莖中的積累過程十分復雜，是蔗糖合成和分解酶類在植物體內共同協作調節的結果，轉化酶 (Invertase，INV)是高等植物體內控制蔗糖分解的關鍵酶，在蔗糖的轉運、貯藏和分配中起作用［2］。而轉化酶抑制子(Invertase inhibitor，InvInh)是體內調節轉化酶活性的關鍵酶［3］。因此，對甘蔗InvInh家族基因進行篩選、克隆和組織特異性表達研究，對進一步研究InvInh對轉化酶的抑制機理及其在探明蔗糖積累中所起的作用均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】InvInh是轉化酶翻譯后調節的一個重要因子，存在于植物發育的特定階段，且只對酸性轉化酶起抑制作用［4］。InvInh家族基因可分為液泡轉化酶抑制子(Vacuolar invertase inhibitors，VIFs)、細胞壁結合轉化酶抑制子(Cell wall invertase inhibitors，CIFs)和定位不明確或同時對二者都具有抑制作用的抑制子(C/VIF)［5］。目前，已經從番茄、擬南芥、大豆、玉米和鐵皮石斛等植物中克隆到InvInh基因，它們編碼的氨基酸序列不保守，在不同物種間變異較大，但該類蛋白N端都具有4個不對稱的α螺旋結構和4個保守的Cys位點［2，6］。InvInh和INV以離子鍵相結合，能形成InvInh/INV復合物，當純化的InvInh蛋白加入煙草懸浮培養細胞，INV酶活性受到抑制［7］。蔗糖濃度［8］、pH 值［9］和 SnPK 磷酸化［10］等是影響InvInh與INV結合的重要調控因子，它們或通過與InvInh蛋白結合形成復合物，抑制其與INV結合，或影響InvInh與INV的結合效率。InvInh酶活性具有劑量依賴型，其使INV酶活性降低50%的 Ki值為 3.82 ×10－5mol/L［11－12］。課題組前期從甘蔗中克隆到一個SoInvInh1基因，相關性分析表明在甘蔗成熟期蔗莖中SoInvInh1基因可能與酸性轉化酶活性密切相關［13］。蔗莖中SAI酶和NI酶活性降低有利于蔗糖積累，而節間細胞壁結合轉化酶(CIN)酶活性提高，有利于蔗糖從低濃度節間向高濃度節間的運輸。而節間SoInvInh2基因表達量與CIN酶活性呈正相關，推測該基因可能是節間CIN酶活性重要調節因子［14］?！颈狙芯壳腥朦c】在前期對甘蔗INV家族基因表達和功能研究的基礎上，擬從NCBI基因庫 Genbank篩選 InvInh基因，利用Vector NTI 11.0軟件在InvInh基因核苷酸序列保守區域設計引物，采用同源克隆技術從甘蔗中克隆InvInh家族基因?！緮M解決的關鍵問題】根據玉米ZmInvInh2基因核苷酸序列，采用同源克隆和熱不對稱交錯PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR，Tail-PCR)技術，以甘蔗品種GT28幼莖cDNA為模板，克隆甘蔗InvInh家族基因成員，利用生物信息學軟件分析InvInh蛋白的理化特性和蛋白結構，并利用qRT-PCR分析InvInh在甘蔗不同組織部位的表達特性，為后續深入研究該基因在甘蔗蔗糖代謝和積累中的作用的提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以特早熟、特高糖、高產、宿根性好和抗逆性強，在廣西南寧地區易于開花的甘蔗品種桂糖28號(GT28)為材料［15］。于2012年1月20日種植于廣西大學農學院甘蔗資源圃，分別在甘蔗不同生育期取樣:伸長期(自甘蔗開始拔節起至伸長基本停止的時期)、工藝成熟期(蔗莖中蔗糖分積累達到最高峰，蔗汁純度最適合壓榨制糖的時期)、生理成熟前期(甘蔗生長錐分化為花芽到未抽穗的時期)、生理成熟后期(甘蔗抽穗之后到開花結實時期)，相應的取材時間為2012年8月22日、2012年12月22日、2013年1月22日和2013年2月22日。采樣時以頂端第1片完全展開葉為+1葉，即成熟葉，處于頂端中心位置還沒有展開的葉為幼葉，甘蔗靠近莖基部的葉片為老葉。幼莖為幼葉包裹的未成熟莖，成熟莖為蔗莖中部已經完全成熟的莖，老莖為靠近蔗莖基部的莖。

1.2 試劑和儀器

RNA提取TRIzol試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司;RNA反轉錄試劑盒購于Fermentas(美國);Ex Taq酶、dNTPs、pMD18-T 載體、Genome Walking Kit、PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser和SYBR Premix Ex TapⅡ購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司。供試特異引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。實時熒光定量PCR采用ABI Stepone Plus型熒光定量PCR儀(美國)。

1.3 轉化酶抑制子SoInvInh2全長序列的克隆

1.3.1 5'片段克隆 以報道的玉米 ZmInvInh2(登錄號EU951975)基因的cDNA序列，運用NCBI網站上Blastn程序在GenBank數據庫中進行同源序列搜索，選取與甘蔗親緣關系較近植物的核苷酸序列進行比對分析，在其保守性較高的區域設計1對特異引物H2F1和H2R1(表1)，用于SoInvInh2中間片段的克隆。以甘蔗幼莖cDNA為模板，引物H2F1和H2R1的PCR擴增程序:94℃預變性5 min;94℃變性50 s，59℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環;最后72℃延伸10 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收純化后，將其連接到pMD18-T體上，連接產物轉入感受態細胞DH5α，進行藍白斑篩選。挑選白色單菌落，采用通用引物M13進行菌液PCR擴增，將能擴增出目的條帶的菌液，送深圳華大基因研究院進行測序驗證。

表1 甘蔗SoInvInh2基因的克隆和實時熒光定量PCR引物Table 1 Primers sequences for cloning and qRT-PCR of SoInvInh2 gene

1.3.2 3'片段克隆 以甘蔗幼莖RNA 為模板，利用引物GZS反轉錄合成cDNA。依據上一步克隆到的5'片段序列，設計3條特異性上游引物H2F2、H2F3和H2F4(表1)。下游引物為XP1，按照Genome Walking Kit試劑盒說明書進行Tail-PCR擴增。第1輪PCR擴增:以甘蔗幼莖cDNA為模板，擴增體系為 50 μl，含 cDNA 模板 4.0 μl、dNTP Mixture(2.5 mmol/L)8.0 μl、10 × LA PCR Buffer II(Mg2+Plus)5.0μl、LA Taq(2.5 U/μl)0.5 μl、上游引物 H2F2(100 pmol/μl)1.0 μl、下游引物 XP1(10 pmol/μl)1.0 μl、ddH2O 30.5 μl。其 PCR 擴增條件如下:94℃ 1 min，98℃ 1 min;94℃ 30 s，61.5℃1 min，72 ℃ 2.5 min，進行 5 個循環;94 ℃ 30 s，25℃ 3 min，72 ℃ 2.5 min;94 ℃ 30 s，61.5 ℃ 1 min，72 ℃ 2.5 min，94 ℃ 30 s，61.5 ℃ 1 min，72 ℃ 2.5 min，94 ℃ 30 s，42 ℃ 1 min，72 ℃ 2.5 min，進行15個循環;72℃ 10 min，4℃保存。第2輪PCR擴增:取1.0 μl上述反應的PCR產物作為模板，以H2F3和XP1為引物，引物H2F3的退火溫度為60℃，擴增反應液和擴增體系同第1輪擴增。第3輪擴增體系與第2輪相同，引物H2F4退火溫度為61.5℃。取第3輪PCR擴增產物進行電泳檢測，產物經膠回收純化后克隆到pMD18-T載體，經菌液PCR擴增檢測后，送深圳華大基因研究院測序驗證。

利用軟件ContigExpress將克隆到的2個核苷酸序列進行拼接，然后利用 NCBI網站上的 Open Reading Frame Finder對拼接結果進行編碼區分析。在編碼區序列設計2對引物:H2F11、H2F12、H2R11和H2R12(表1)。分別以花序軸和花序cDNA為模板，引物組合:A:H2F11和 H2R12;B:H2F12和H2R11;C:H2F12和 H2R12。PCR擴增程序為94℃預變性5 min;94℃變性50 s，56～60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環;最后72℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳分析3對引物的PCR擴增特異性，并進行測序驗證。

1.4 生物信息學分析

利用 http://web.expasy.org/protparam 分析編碼蛋白的氨基酸組成、理論分子量和等電點;利用http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html分析跨膜結構;利用http://linux1.softberry.com分析蛋白的亞細胞定位;利用http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP 分析蛋白質信號肽;利用 http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan 分析蛋白的活性位點;利用Vector NTI Advance 11.0進行基因氨基酸序列同源性比對分析;利用MEGA7.0軟件構建基因系統進化樹。

1.5 熒光定量PCR

經引物擴增特異性和擴增效率驗證，SoInvInh2基因熒光定量引物為T2F22和T2R22(表1)，內參引物和qRT-PCR擴增體系參照?？∑娴龋?3］的方法。采用2－ΔΔCT法分析基因的相對表達量。

1.6 統計分析

試驗數據采用Excel 2007進行統計分析及制圖。

2 結果與分析

2.1 SoInvInh2基因的克隆

從引物H2F1和H2R1的PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果可見(圖1-A)，PCR擴增產物電泳條帶清晰且單一，序列測序結果為623 bp。利用Blastn進行同源性比對分析，該序列與高粱(XM002447788)和玉米(EU966246)轉化酶抑制子同源性分別為86%和85%，說明克隆到的是甘蔗InvInh基因，該基因與甘蔗SoInvInh1(KF575175)核苷酸序列同源性為60%，因此克隆到的是一個新的甘蔗InvInh基因家族成員，命名為:SoInvInh2。該基因在 GenBank數據庫注冊號為 KF575170。利用Tail-PCR擴增出PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測如圖1-B所示，擴增條帶單一，序列測序結果為327 bp。

利用ContigExpress將5'和3'片段核苷酸序列進行拼接，獲得SoInvInh2全長cDNA序列，全長927 bp，其中編碼區序列為651 bp，編碼216個氨基酸，5'UTR(Untranslated Region，非翻譯序列)長2 bp，3'UTR長274 bp，并帶有真核生物典型的poly A尾巴(圖2)。

圖1 PCR擴增結果電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR product

分別以花序軸和花序cDNA為模板，引物對A、B和C的PCR擴增產物電泳檢測如圖3所示。引物對A擴增出的條帶，經測序驗證為非目的基因。引物對B在花序軸cDNA擴增的條帶清新，但在花序cDNA中擴增的結果不理想。而引物對C在花序軸和花序cDNA中均能擴增出目的條帶，經測序序列大小為651 bp，與拼接結果的核苷酸序列同源性為99.8%，說明引物對C可以用于擴增SoInvInh2基因編碼區序列。而以甘蔗gDNA為模板，引物對C的PCR擴增產物經測序大小也為651 bp，與SoInvInh2基因的cDNA核苷酸序列同源為100%，說明SoInvInh2基因不含內含子序列。

圖2 SoInvInh2基因的cDNA序列及預測氨基酸序列Fig.2 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of SoInvInh2 gene

圖3 SoInvInh2開放閱讀框驗證Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR product of SoInvInh2 gene

2.2 SoInvInh2蛋白的生物信息學分析

利用BioXM 2.6軟件對SoInvInh2編碼區核苷酸序列進行分析，序列含A(腺嘌呤)111個、G(鳥嘌呤)186個、C(胞嘧啶)270個、T(胸腺嘧啶)84個，GC含量為70.05%，A+T含量為29.95%。該蛋白預測分子量為22.98 kD，等電點pI為7.8。帶負電荷的氨基酸占19.44%，帶正電荷的氨基酸占10.19%。SignalP4.1預測表明，SoInvInh2蛋白不存在信號肽。該蛋白的不穩定指數為32.34，為穩定蛋白。平均疏水性為 －0.034，為親水性蛋白。TMHMM Server v.2.0預測該蛋白在N端具有跨膜結構。49～206 aa是PMEI蛋白的保守結構域，該蛋白屬于InvI/PMEI家族成員。該蛋白含有3個糖基化位點:59～62、96～99和106～109 aa;3個絡蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點:62～65、78～81和141～144 aa;丙氨酸富集區:69～157 aa。

利用 http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred 對 So-InvInh2編碼蛋白的二級結構進行預測(圖4)，二級結構有8個 α-螺旋，不含 β-折疊。其中 α-螺旋占72%、無規則卷曲占23%，延伸鏈占5%。利用Phyre2預測SoInvInh2蛋白的三級結構具有4個α-螺旋。

運用Vector NTI Advance 11軟件上的AlignX對不同植物的InvInh的氨基酸序列進行比對分析，甘蔗SoInvInh2與玉米、高粱、水稻、擬南芥和馬鈴薯InvInh2的氨基酸序列的同源性分別為81%、80%、60%、37%和35%。InvInh2s蛋白在5'端同源性較低，在單子葉和雙子葉植物之間，氨基酸序列同源性低于40%。9個不同來源的氨基酸序列比對結果如圖5所示，InvInh2s蛋白在3'端同源性較高，其中4個保守的 Cys位點，分別位于第2、3、7和8個α-螺旋上。

2.3 InvInhs系統進化分析

利用MEGA7.0軟件構建InvInhs系統進化樹(圖6)，植物InvInhs可以聚為4類:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。其中Ⅰ類為單子葉植物InvInh2，Ⅱ類為雙子葉植物InvInh2，Ⅲ類為單子葉植物InvInh1，Ⅳ為雙子葉植物InvInh1。甘蔗SoInvInh1和SoInvInh2分別屬于Ⅲ類和Ⅰ類。從進化關系看，Ⅰ類和Ⅱ類進化關系比較近，而與同是單子葉植物類的Ⅲ類的進化關系較遠，說明InvInhs蛋白又可以分為2個大類:Ⅰ和Ⅱ歸為一類、Ⅲ和Ⅳ又歸為另一類。

2.4 SoInvInh2基因在甘蔗不同生長期的時空表達分析

圖4 SoInvInh2蛋白的二級結構Fig.4 Predicted secondary structure of SoInvInh1 protein

圖5 SoInvInh2氨基酸序列與其他物種氨基酸序列多重比對Fig.5 Alignment of SoInvInh2 its homologous based on amino acid sequences

在甘蔗伸長期(圖7 A)，SoInvInh2的表達量在成熟莖中表達量最高，在成熟葉中最低，成熟莖中基因表達量是成熟葉中的70.9倍。在葉中SoInvInh2表達量呈現出老葉＞幼葉＞成熟葉，在莖中SoInvInh2表達量呈現出成熟莖＞老莖＞幼莖。在甘蔗工藝成熟期(圖7-B)，SoInvInh2在幼葉中表達量最高，老葉次之，成熟莖中表達量最低。葉中該基因表達呈“幼葉＞老葉＞成熟葉”的趨勢，其中SoInvInh2在幼葉中基因的表達量是老葉的2.5倍，是成熟葉的2.2倍。在莖中SoInvInh2表達量呈現出“幼莖＞老莖＞成熟莖”，幼莖中基因表達量是成熟莖中的3.4倍。在甘蔗生理成熟前期(圖7-C)，SoInvInh2在莖中基因表達量呈幼莖＞成熟莖＞老莖。SoInvInh2表達量在幼莖中最大，老葉中次之，成熟葉中最低。在甘蔗生理成熟后期(圖7-D)，葉中SoInvInh2表達量表現為:老葉＞幼葉＞成熟葉，莖中表現為:成熟莖＞幼莖＞老莖。SoInvInh2在老葉中基因相對表達量最大，花序中次之，幼莖中最低，其中老葉中基因表達量是幼莖中的11.7倍。SoInvInh2在花序中基因表達量是花序軸中1.6倍。

3 討論

克隆基因3'側翼未知序列常采用3'RACE試劑盒，一般都能克隆獲得基因未知核苷酸序列，但本研究前期采用3'RACE試劑盒并未克隆到SoInvInh2基因3'片段序列，而采用Tail-PCR技術能成功克隆出。Tail-PCR技術雖然需要較多引物組合，擴增條件精細，但其操作簡便、快捷、擴增特異性高，常用于基因側翼序列的克?。?6］。進一步分析發現 SoInvInh2基因的核苷酸序列GC含量高達70%以上。PCR擴增GC含量較高的基因，退火時核苷酸序列容易形成復雜的發夾結構從而干擾擴增，可以適當減少退火時間、或在PCR反應體系中加入亞甲基砜和甜菜堿都能提高引物的擴增效率［17］。本研究也證明采用Genome Walking Kit試劑盒和引物XP1組合適用于擴增甘蔗高GC含量的基因。

InvInh蛋白具有4個不對稱的α螺旋結構和4個保守的Cys位點，它們在穩定InvInh蛋白構型和功能中起作用。4個不對稱α螺旋在維持InvInh蛋白結構的完整性中起重要作用，而4個α螺旋結合區是與酸性轉化酶結合的重要區域［18］。4個保守的Cys位點，能形成2個分子內二硫鍵，具有穩定肽鏈空間結構的作用。而分子內二硫鍵內被DTT破壞，InvInh 蛋白即失去抑制作用［2］。Hothorn 等［9］進一步研究證實煙草InvInh蛋白在高溫和低pH值下能保持穩定，就是由于Cys間形成分子內結構穩定二硫橋的緣故。本研究克隆到的SoInvInh2蛋白具有4個不對稱的α螺旋結構和4個保守的Cys位點，因此推測該蛋白可能具有抑制INV酶活性的作用。

圖6 InvInhs進化關系分析Fig.6 Phylogenetic tree of InvInhs protein

圖7 甘蔗不同生長時期SoInvInh2表達分析Fig.7 Expression analysis of SoInvInh2 at different growth stages of sugarcane

系統進化分析表明，植物InvInhs蛋白可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 4個亞家族。從進化關系看，Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ亞家族蛋白的親緣關系較近，而Ⅰ和Ⅲ亞家族蛋白的親緣關系較遠，這與Di Matteo等［5］將InvInh分成液泡轉化酶抑制子VIF和細胞壁結合轉化酶CIF的分類結果相一致，即VIF與CIF家族蛋白之間所推導的氨基酸序列的同源性較低。由于植物液泡轉化酶(SAI)和細胞壁結合轉化酶(CIN)都是多家族基因，提取、分離和純化這兩種酶比較困難，且InvInh/INV復合物具有高度特異性，InvInh對不同物種INV抑制作用存在較大差異［19］。因此Ⅰ和Ⅱ亞家族成員是屬于VIF亞家族，還是屬于CIF亞家族，還需要進一步研究。但該類蛋白具有明顯的共同特征:屬于非糖基化蛋白，其分子量為17～23 kD;具熱穩定性，短時高溫仍具有抑制INV活性的作用;對INV具有交叉抑制作用［20］。

基因表達模式分析可為基因功能的揭示提供重要線索。本研究結果表明SoInvInh2基因表達具有組織表達特異性，但該基因在甘蔗不同生育期葉和莖中的表達模式無明顯規律。前期研究表明甘蔗成熟期節中SoInvInh2基因與CIN酶活性呈正相關性，表明二者可能存在協同表達［14］。在煙草中過表達SoInvInh2基因，轉基因植株中CIN酶活性在葉、根和莖中的酶活性與SoInvInh2基因表達量呈顯著負相關，說明過表達SoInvInh2基因，可能翻譯成了有活性的SoInvInh2蛋白，從而抑制了 CIN的酶活性［21］。在番茄中沉默InvInh1基因的表達，可以提高CIN酶活性，抗寒性提高。而過表達InvInh1，能抑制 CIN酶活性，己糖含量降低，對低溫敏感［21－22］。在番茄、大豆和擬南芥研究中都發現，CIF能抑制CIN酶活性，能延緩細胞衰老和增加種子重量［24－25］。大量研究表明，通過轉基因技術過表達InvInh基因，能抑制酸性轉化酶的活性，進而調節蔗糖代謝和庫強。下一步將構建SoInvInh2基因正義和RNAi干擾植物表達載體，并將其導回甘蔗中。通過轉基因植株性狀表現，結合InvInh2基因表達特性驗證甘蔗SoInvInh2基因的功能，闡明甘蔗糖分積累過程中InvInh與INV的互作機制，為能動調控甘蔗糖分積累提供參考。

4 結論

從甘蔗中克隆到一個新的轉化酶抑制子基因SoInvInh2，編碼216個氨基酸，分子量為22.98 kD，等電點為7.8。核苷酸序列GC含量在70%以上，屬于高GC含量基因?；虿缓瑑群有蛄?，其編碼蛋白具有4不對稱的α-螺旋和4個保守的Cys位點。49～206 aa是PMEI蛋白的保守結構域，屬于InvI/PMEI家族成員。植物InvInhs蛋白可以分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四個亞家族，SoInvInh2蛋白屬于Ⅰ亞家族。SoInvInh2基因具有組織表達特異性，但在甘蔗不同生育期葉和莖中的基因表達模式無明顯規律。