伊立替康誘導結腸癌細胞凋亡的分子機制

黃 河 魏 童 高文彪

(新疆醫科大學第五附屬醫院胃腸外科，新疆 烏魯木齊 830011)

伊立替康是喜樹堿衍生物，在機體內可以轉變為具有藥理活性的代謝產物。伊立替康和其代謝產物廣泛分布在肝臟和腸道〔1〕，其活性代謝產物與DNA拓撲異構酶Ⅰ相互作用，通過阻斷酶與DNA結合影響DNA 復制，形成無法逆轉的DNA雙鏈斷裂，導致細胞周期阻滯和細胞死亡〔2〕。此外，對于多重耐藥的癌細胞系也有部分活性〔3〕。然而，惡性結腸癌細胞仍有可能通過DNA損傷引起基因突變，或通過激活其他保護機制例如細胞自噬，對伊立替康耐藥〔4〕。

腫瘤發生發展的作用機制并不十分清楚，p38與細胞類型、癌癥分期、活化程度有關〔5〕。有研究提出，p38通過誘導細胞存活信號防止過早凋亡，并對損傷的DNA進行修復，扮演著保護細胞的重要角色〔6〕。激活的p38可以引起炎性細胞因子和酶的表達，促進血管生成與腫瘤轉移。在結腸癌組織中，p38α是細胞增殖和生存所必需的，抑制p38α將導致細胞周期阻滯，細胞凋亡或自噬性細胞死亡〔7，8〕。

本研究考察了不同濃度的伊立替康對結腸癌細胞SW620凋亡的影響，探討p38在伊立替康誘導結腸癌凋亡過程中的作用。

1 材料和方法

1.1實驗材料 人類結腸癌細胞株SW620購自ATCC公司；伊立替康購自pfizer公司；MTT、二甲基亞砜(DMSO)、DAPI、碘化丙啶(PI)、p38特異性抑制劑SB 203580購自Sigma-Aldrich公司。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、SignalSilence?p38 MAPK siRNA試劑盒購自CST公司。胎牛血清、DMEM培養基購自Thermo Fisher 公司，其他試劑均購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養 用含10%胎牛血清(FBS)、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養基培養人類結腸癌細胞株SW620。在溫度為37℃、CO2體積分數為5%的飽和濕度孵育箱中培養。每周2次傳代2次，待細胞密度超過90%后使用0.05%胰蛋白酶消化，操作過程確保無菌。使用DMSO作為稀釋劑配制SB 203580原液。SB 203580(10 μmol/L)溶液在伊立替康前20 min加入細胞培養液。

1.2.2MTT法檢測伊立替康對SW620細胞的毒性作用 將結腸癌細胞SW620接種于96孔板中，用不同濃度的伊立替康處理，在顯微鏡下觀察細胞的存活情況。用磷酸鹽緩沖液(PBS)小心沖洗2～3遍，然后加入10 μl 5 mg/ml MTT溶液，置于培養箱中繼續培養4 h。每孔加入150 μl DMSO，在搖床上低速振蕩15 min，使結晶物能夠充分溶解。在酶標儀490 nm處測定各孔的吸光度值。

1.2.3ELISA測定p38 活性 伊立替康處理后的結腸癌細胞通過離心收集上清，所有細胞分組的預處理和p38活性測定按照ELISA試劑盒說明書操作。對不同樣品進行測定，根據數據繪制p38和磷酸化p38的標準曲線。以磷酸化p38與同一樣品中的總p38的比值作為p38活性指標。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 使用碘化丙啶染色對不同濃度伊立替康處理的結腸癌細胞的凋亡進行定量。細胞用胰蛋白酶消化后，收集細胞，用 PBS洗滌，離心去PBS，用預冷的70%乙醇在4℃固定2 h。沖洗后細胞重懸于含0.1% Triton X-100、50 μg/ml RNaseA和0.5 μg/ml碘化丙啶的溶液中，避光孵育30 min。通過流式細胞儀測定細胞樣本中的凋亡比率。

1.2.5siRNA實驗 使用SignalSilence?p38 MAPK siRNA試劑盒(Cell Signaling Technology公司)，根據說明書步驟操作，特異性沉默p38 MAPK的表達。細胞穩定轉染siRNA 48 h后，加入伊立替康作用并觀察細胞的增殖和凋亡情況。

1.3統計學分析 采用SPSS17.0統計軟件進行單因素方差分析，LSD-t檢驗進行組間均數的比較。

2 結 果

2.1不同濃度伊立替康對結腸癌細胞SW620生長的抑制作用 伊立替康抑制細胞生長和增殖，與其濃度和時間有關，呈劑量依賴性和時間依賴性(P<0.05)。見表1，圖1，圖2。

2.2伊立替康誘導SW620細胞凋亡 10、20 μmol/L伊立替康并不能顯著引起結腸癌細胞凋亡〔細胞凋亡率為(5.47±1.23)%，(9.23±1.57)%〕，直到濃度增加至40、80 μmol/L，導致細胞顯著凋亡增加〔細胞凋亡率分別為(20.83±2.51)%，(41.25±2.49)%〕，100 μmol/L伊立替康作用于SW620細胞后凋亡率升至(49.37±2.35)%與空白對照組(0%)相比差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3p38 在伊立替康誘導SW620細胞凋亡過程中的活性變化 40 μmol/L伊立替康處理 SW620細胞，p38的激活相對較為緩慢；伊立替康作用24 h后，p38活性明顯增加并且不斷提高直至實驗結束(48 h)。然而，100 μmol/L伊立替康處理SW620細胞過程中，p38活性在約 12 h內急劇升高，達到峰值，接著慢慢地減弱直到試驗結束。值得注意的是，在作用48 h后，p38 活性幾乎達到基底水平。見表2。

表1 不同濃度伊立替康處理SW620 細胞不同時間后存活細胞比例

相同時間，不同濃度組間比較：1)P<0.05

圖1 不同濃度伊立替康作用于SW620 細胞24 h后的電子顯微照片(×10 000)

圖2 0 μmol/L和40 μmol/L伊立替康分別作用于SW620細胞0、24、48、72 h的電子顯微照片(×10 000)

時間(h)40 μmol/L100 μmol/L0100.00100.002104.13±6.86104.02±6.744105.94±7.65109.92±7.768106.67±7.68117.68±8.1912108.56±7.69137.87±14.232)16115.78±7.931)132.67±13.562)24121.46±9.371)128.35±10.892)36126.83±9.761)118.76±8.8648133.75±13.891)110.23±7.84

與0、2、4、8、12 h比較：1)P<0.05;與0、2、4、8、36、48 h比較：2)P<0.05

2.4p38 MAPK通路在伊立替康誘導SW620細胞凋亡中的作用 使用化學抑制劑 SB203580及siRNA干擾技術特異性抑制p38的表達，然后給予伊立替康處理細胞，結果表明兩者均能使p38 MAPK信號通路的活性顯著降低。兩種方法聯用會導致p38幾乎完全失活。見表3。

當p38 MAPK的活性被抑制時，用40 μmol/L伊立替康處理結腸癌細胞，發現SW620細胞凋亡明顯增加，并且在48 h后達到峰值。此外，40 μmol/L伊立替康作用24 h后，與對照組比較，存活細胞百分比顯著降低。100 μmol/L伊立替康處理組則表現出相反的效應，在整個實驗期間，p38活性被抑制后，加入伊立替康作用不同時間，SW620細胞凋亡減少，同時存活細胞百分比明顯增加，特別是在24 h和48 h之間的時間段。見表4、表5。

表3 加入抑制劑SB203580 或轉染p38 siRNA后p38的活性變化

與伊立替康組比較：1)P<0.05

表4 p38活性被抑制后，40 μmol/L伊立替康處理SW620細胞不同時間，細胞的凋亡、存活比例

與同組其他時間點比較：1)P<0.05；下表同

表5 p38活性被抑制后，100 μmol/L伊立替康處理SW620細胞不同時間，細胞的凋亡、存活比例

3 討 論

有研究報道伊立替康及其他抑制細胞生長的藥物在多種惡性腫瘤細胞中會激活 p38 MAPK〔9，10〕。 p38信號似乎與抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL有關，隨著DNA損傷，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達增加〔11〕。另一方面，p38 還可能通過直接激活 p53〔12〕或通過控制轉錄〔13〕來調節細胞增殖和凋亡。因此，在細胞生長抑制劑治療惡性腫瘤的過程中，p38對細胞存活和凋亡有至關重要的調控作用。本研究發現，伊立替康激活相關信號誘導細胞凋亡，且具有劑量依賴性。此外，在伊立替康治療結腸癌的體外模型中驗證了p38 MAPK信號通路的潛在作用。本實驗數據表明，伊立替康抑制細胞的生長和增殖，呈劑量和時間依賴性，且濃度在 40 μmol/L出現明顯的細胞毒性，進一步的實驗顯示較低濃度伊立替康作用12 h，p38活性繼續穩步增加，同時發生有限的細胞凋亡。當p38的活性被抑制后，給予伊立替康作用12 h，細胞凋亡明顯增加，直至實驗結束(48 h)。在此濃度下，p38的活性和細胞凋亡之間有直接的因果關系。此外，p38 MAPK信號通路被抑制的細胞組，細胞存活率也相應降低。有研究提出在癌細胞中p38信號代表了早期應激反應，使細胞有時間來評估損傷程度，進行修復〔14〕。在結腸癌細胞中p38具有潛在控制自噬的保護性作用〔15〕。以熱休克蛋白(Hsp)27表達增加為例可以推斷，隨著p38活性緩慢而持續地增強，激活了特定的自我保護機制，一定程度上抑制了細胞凋亡的關鍵信號〔16〕。另一方面，隨著高劑量伊立替康治療導致p38活性快速增加，存活信號可能切換為細胞凋亡信號，進而導致細胞死亡。當給予抑制劑SB203580 或siRNA沉默p38的表達時，細胞凋亡明顯減少，同時細胞存活率也相應提高。p38可能通過誘導凋亡前體蛋白的表達，如死亡受體、Fas及其配體FasL及Bax、Bcl-2家族的Bim或Noxa〔17，18〕，促進細胞凋亡。已知p38關聯多種凋亡途徑的表達或活性，如c-FLIP，Bcl-2，ERKs和Akt信號轉導通路〔19，20〕。p38也有可能通過促進線粒體凋亡信號活性導致細胞凋亡〔21〕。所以，關于p38 MAPK在伊立替康治療結腸癌過程中扮演的角色仍需進一步研究?？傊?，伊立替康處理SW620 結腸癌細胞過程中激活p38通路，呈劑量依賴性。低劑量伊立替康誘導p38 活性緩慢增長，從而激活生存機制，如Hsp27表達抑制細胞凋亡。相反，較高劑量伊立替康可導致 p38 活性迅速增加，誘導細胞凋亡。