巴什拜羊A-FABP、PBDC1基因多態性及其與巴什拜羊生長性狀的相關分析

熱依拉·普拉提，黃李勇，趙 雄，依明·蘇來曼*

(1.新疆維吾爾自治區畜牧總站，烏魯木齊 830001；2.新疆農業大學動物科學學院，烏魯木齊 830052）

脂肪型脂肪酸結合蛋白(adipocyte fatty-acid binding protein，A-FABP)屬于脂肪酸結合蛋白家族。目前研究發現FABPs家族至少包括9種蛋白，且該家族蛋白在細胞脂肪酸代謝及轉運中發揮重要作用[1]，在哺乳動物中，A-FABP蛋白主要在脂肪細胞中表達并參與甘油三酯的形成及脂肪沉積[2、3]。A-FABP基因多態性研究表明，雞[4]、鴨[5]、牛[6]、豬[7]的A-FABP基因多態性與肌內脂肪沉積相關，可作為重要的候選基因進行研究。PBDC1是含有198個氨基酸的多糖生物合成域1蛋白 （polysaccharide biosyn-thesis domain-containing1，PBDC1），分子質量約為22.2 kDa。PBDC1基因位于小鼠染色體上,其全長cDNA為597 bp[8]。前期工作研究發現，在丁酸鈉誘導MEL細胞分化的過程中PBDC1的蛋白含量逐漸下調。由此推測PBDC1蛋白可能與誘導的MEL細胞分化有關，而目前，關于PBDC1蛋白在動物中多態性研究較少。鑒于A-FABP和PBDC1基因的功能和作用，將二者作為與生產性狀相關的候選基因來研究，對以后的動物分子育種和標記輔助選擇具有一定的應用價值。

巴什拜羊是上世紀初期，哈薩克族愛國人士巴什拜·喬拉克·巴平選用哈薩克羊中優秀母羊作為母本，并嚴格選育優良種公羊，同時導入野生盤羊進行長期的雜交選育而形成的優良地方品種[9]。具有耐寒、適應性強、生長速度快、早熟、肉質鮮美等特點。巴什拜羊原產于裕民縣的巴爾魯克山區[10]，現今主要分布在塔城地區的裕民縣、額敏縣、塔城市以及托里縣。根據2014年統計結果顯示塔城地區的巴什拜羊年底存欄總數已達150萬只[11]。目前，關于巴什拜羊生長發育性狀候選基因的標記輔助選擇研究報道較少。本研究對巴什拜羊A-FABP和PBDC1基因進行多態性分析，探討基因多態性與生長指標的關系，期望為后期巴什拜羊分子育種提供有利的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本選擇

在新疆裕民縣巴什拜羊繁育基地隨機的選取120只年齡1.5歲的純種巴什拜羊作為試驗羊。頸靜脈采血5 mL/只，枸櫞酸鈉抗凝，放于冰盒中帶回實驗室，-20℃保存備用。

1.1.2 試劑與藥品

Tris平衡酚，無水乙醇，70%無水乙醇，2×Taq PCR MasterMix，6×Loading Buffer，核酸提取液，DL2000，ddH2O，蒸餾水，甲醛，30%非變性聚丙烯酰胺，T10E10，T10E1，瓊脂糖粉，硝酸銀，氫氧化鈉等。

1.1.3 試驗儀器

電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠；TGL-16M高速臺式冷凍離心機：湘儀公司；TGL-16M微量高速離心機：湘儀公司；Biometra梯度PCR儀：德國Biometra公司；凝膠成像儀：美國Bio-Rad；HS-3垂直混合器：上海一恒科學儀器有限公司；WD-9405B型水平搖床：北京市六一儀器廠；立式高壓滅菌鍋：博迅實業有限公司；旋渦混合儀：滬西分析儀器廠；微量進樣器：上海高鴿工貿有限公司；移液器：上海萬島儀器科技有限公司微波爐：Galanz公司；低溫冰箱：海爾集團；冰柜：海爾集團。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取

采用酚-氯仿抽提法，抽提巴什拜羊血液中基因組DNA，溶于配好的T10E1溶液中，-20℃保存備用。

1.2.2 引物的設計與合成

參考 Genbank數據庫所公布的綿羊 A-FABP基因序列 （NC_019466.2）、PBDC1基因序列（NC_019484.2），利用Premier5.0軟件設計引物，引物序列見表1。由上海生物工程有限公司進行引物合成。

表1 引物序列信息

1.2.3 PCR擴增體系與反應條件

PCR 反應體系 20 μL：PCR MasterMix10 μL，DNA 模板（100 ng/uL）1 μL，上、下游引物（10 pmol/uL）各 0.5 μL，加 ddH2O 至 20 μL。反應條件：94 ℃預變性 5 min，94 ℃變性 30 s，退火 30 s（退火溫度見表 1），72℃延伸1 min，35個循環，72℃延伸5 min，4℃保存，產物用1.5%瓊脂糖凝膠進行檢測。

1.2.4 PCR-SSCP檢測

參考周延清[12]等的方法對PCR產物進行SSCP分析，并判定各種基因型。

1.2.5 DNA測序

選取不同基因型的PCR擴增產物進行測序。測序結果運用Chromas軟件和DNAMAN軟件進行分析

1.2.6 體尺指標測定

參照《羊生產學》的方法[13]，對試驗羊的體長、體高、體重、管圍及胸圍進行實地測量，并記錄測量數據。

1.2.7 數據統計與分析

運用軟件PIC-CALC與POPGENE32計算巴什拜羊A-FABP、PBDC1基因的基因型頻率、等位基因頻率、有效等位基因數(Ne)、多態信息含量(PIC)、雜合度(He)和純合度(Ho)。運用Microsoft Excel 2003對巴什拜羊體重、體高、管圍、體長等數據進行整理分析；運用SPSS 21.0軟件中的方差分析對個體基因型與巴什拜羊的體尺數據進行顯著性檢驗，以“最小二乘均值士標準誤”表示。

2 試驗結果與分析

2.1 基因組DNA檢測

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA樣品，結果如圖1所示，基因組DNA條帶清晰，酶標儀檢測結果顯示DNA OD260/OD280值在1.6～1.8，表明基因組DNA的純度比較好，可用于續試驗。

2.2 巴什拜羊A-FABP、PBDC1基因的PCR檢測

1.5%的瓊脂糖凝膠檢測A-FABP、PBDC1基因的PCR擴增產物，結果如圖2、3、4所示，PCR擴增得到清晰明亮的單一條帶，且擴增片段分別為157 bp、117 bp、234 bp與預期結果一致，符合SSCP試驗要求。

圖1 巴什拜羊基因組DNA檢測結果

圖2 A-FABP基因外顯子2 PCR檢測結果

圖3 A-FABP基因外顯子3 PCR檢測結果

圖4 PBDC1基因外顯子1 PCR檢測結果

2.3 SSCP檢測結果

對A-FABP和PBDC1基因各引物的PCR擴增產物進行SSCP檢測。在A-FABP基因的外顯子2擴增片段上存在2種基因型，分別定義為GG型和GA型（圖5），而在外顯子3擴增片段上未檢測到多態性存在（圖6）；在PBDC1基因的外顯子2擴增片段上存在2種基因型，分別定義為AA型和AB型（圖7）。

圖5 A-FABP基因外顯子2分型圖

圖6 A-FABP基因外顯子3分型圖

圖7 PBDC1基因外顯子1分型圖

2.4 測序結果分析

選擇A-FABP和PBDC1基因擴增的不同類型的PCR產物進行測序，A-FABP測序結果與Genbank上發表的綿羊A-FABP基因序列（NC_019466.2）進行多序列比較，結果顯示A-FABP基因存在一處突變，在3159bp處存在G→A的突變。結果如圖8、9所示。氨基酸序列分析發現，A-FABP基因在3159bp處存在G→A突變并未使氨基酸發生改變，此位點的突變為同義突變；PBDC1測序結果與Genbank上發表的綿羊PBDC1基因序列 （NC_019484.2）進行多序列分析比較，發現PBDC1基因存在一處突變，在170bp處發生A堿基缺失，結果如圖10、11所示。氨基酸序列分析發現，PBDC1基因在170bp處發生A堿基缺失，使蘇氨酸產生移碼突變。

圖8 A-FABP基因的測序結果

圖9 基因型測序峰圖

圖10 PBDC1基因的測序結果

圖11基因型測序峰圖

2.5 基因群體遺傳結構分析

2.5.1 A-FABP基因群體遺傳結構分析

2.5.1.1 A-FABP基因的基因頻率和基因型頻率 由表2可知，在檢測的巴什拜羊群體中，A-FABP基因存在GG型和GA型2種基因型，基因型頻率為0.700和0.300。G、A基因頻率為0.850和0.150。G為優勢等位基因。經卡方檢驗，A-FABP基因在巴什拜羊群體中處于哈代溫伯格平衡(P＞0.05)。

表2 A-FABP基因的基因型頻率和等位基因頻率

2.5.1.2 A-FABP基因的遺傳參數值 由表3可知，A-FABP基因在巴什拜羊群體中的基因純合度是0.745，基因雜合度是0.255，有效等位基因數是1.342，多態信息含量為0.222，為低度多態位點。

表3 A-FABP基因的基因純合度、雜合度、有效等位基因和多態信息含量

2.5.1.3巴什拜羊A-FABP基因不同基因型與生長性狀的關聯分析 由表4可知，在巴什拜羊群體中，GA型個體的胸圍、體重和體長均顯著高于GG型個體（P＜0.05），GA型個體和GG型個體的體高和管圍等指標差異不顯著（P＞0.05）。因此，初步推測A-FABP基因在3159bp處的突變有可能作為一種遺傳標記，通過對優勢基因型的選擇，加快對巴什拜羊育種的遺傳改良。

表4 A-FABP基因不同基因型與巴什拜羊生長性狀的關系（平均數±標準誤）

2.5.2 PBDC1基因群體遺傳結構分析

2.5.2.1 PBDC1基因的基因頻率和基因型頻率 由表5可知，在檢測的巴什拜羊群體中，PBDC1基因存在AA型和AB型2種基因型，基因型頻率為0.717和0.283。A、B基因頻率為0.858和0.142。A為優勢等位基因。經卡方檢驗，PBDC1基因在巴什拜羊群體中處于哈代溫伯格平衡(P＞0.05)。

表5 PBDC1基因的基因型頻率和等位基因頻率

2.5.2.2 PBDC1基因的遺傳參數值 由表6可知，PBDC1基因在巴什拜羊群體中的基因純合度是0.757，基因雜合度是0.243，有效等位基因數是1.321，多態信息含量為0.214，為低度多態位點。

表6 PBDC1基因的基因純合度、雜合度、有效等位基因和多態信息含量

2.5.2.3 巴什拜羊PBDC1基因不同基因型與生長性狀的關聯分析 由表7可知，在巴什拜羊群體中，AB型個體的體重、體長均顯著高于AA型個體（P＜0.05），AB型個體和AA型個體的胸圍、體高和管圍等指標差異均不顯著（P＞0.05）。因此，初步推測PBDC1基因在170bp處表現的多態有可能作為一種遺傳標記。

表7 PBDC1基因不同基因型與巴什拜羊生長性狀的關系（平均數±標準誤）

3 討 論

3.1 A-FABP、PBDC1基因群體遺傳特征分析

純合度、雜合度、多態信息含量、有效等位基因數等指標可以從不同方向不同角度反映群體的遺傳變異的程度。群體的雜合度與遺傳多樣性密切相關，當群體的遺傳變異較大時群體雜合度越高，說明遺傳多樣性比較豐富，選擇潛力就越大。在本試驗中，A-FABP和PBDC1基因在巴什拜羊群體中的基因純合度分別0.745和0.757，基因雜合度分別為0.255和0.243，多態信息含量為0.222和0.214，且均為低度多態位點。表明A-FABP和PBDC1基因所發生的突變在巴什拜羊群體中遺傳變異較小。

3.2 A-FABP、PBDC1基因多態性與生長性狀的相關分析

近幾年，有較多的研究報道關于A-FABP基因多態性，Yan等[14]對新西蘭8個綿羊品種的A-FABP基因進行研究，發現8處變異位點。Xu等[15]研究發現中國3個地方品種綿羊A-FABP基因在內含子1區域內存在A到G的突變Smith等[16]研究發現澳州美利奴羊A-FABP基因變異與羊毛性狀質量有關。王卓等[6]對秦川牛A-FABP基因進行研究發現第1內含子的突變位點與大理石花紋、嫩度、背膘厚等存在相關性，第4外顯子的GG基因型個體的嫩度、大理石花紋、背膘厚等指標均顯著高于CC基因型個體。Cho等[17]研究發現A-FABP基因外顯子2的突變與牛的背部脂肪厚度有相關性。劉艷妍[18]等對秦川牛的A-FABP基因的多態性及其與肉用性狀的研究發現A-FABP基因5'側翼區的突變對肉牛的產肉性狀影響較大，外顯子2的SNPs與屠宰率、嫩度、胴體長和眼肌面積有相關性，外顯子3的SNPs與眼肌面積有相關性，A-FABP基因的3'側翼區突變與牛胴體深有相關性。本研究以巴什拜羊為研究對象，對AFABP基因的外顯子2和外顯子3區域進行研究，結果發現在A-FABP基因的第3外顯子區域內未檢測到突變，而在A-FABP基因的第2外顯子區域內檢測到多態性，存在2種基因型，分別定義為GG型和GA型，基因型頻率分別是0.700和0.300。測序結果顯示A-FABP基因在3159bp處存在G到A的突變，且該突變為同義突變。大量研究反應出，同義突變可以通過改變蛋白質的結構等方式影響基因的表達、改變基因的翻譯效率、改變mRNA穩定性和定位，最終引起表型數據存在差異[19-21]。周明亮等[22]研究顯示，IGF-I外顯子3區域內A→G并未引起氨基酸改變，但該SNP位點與綿羊斷奶日增重和綿羊出生后的斷奶體重存在顯著相關。本試驗結果也表明GA型個體的胸圍、體重、體長均顯著高于GG型個體（P＜0.05），初步推測A-FABP基因外顯子2的3159bp處存在的多態通過對優勢基因型的選擇，有可能作為一種遺傳標記，可加快對巴什拜羊育種的遺傳改良。

PBDC1是作為一種新發現的蛋白質，目前關于PBDC1的研究相對較少，且關于PBDC1基因多態性的研究還未見報道。本研究以巴什拜羊為研究對象，對PBDC1基因的多態性進行初步探索，結果發現PBDC1基因在第1外顯子的170bp處發生A堿基缺失，存在2種基因型：AA型和AB型，基因型頻率分別是是0.717和0.283。且AB型個體的體重和體長均顯著高于AA型個體（P＜0.05），AB型個體與AA型個體的管圍、體高和胸圍等指標差異不顯著（P＞0.05）。因此，可以初步推測PBDC1基因外顯子1的170bp處表現的多態性，可作為影響巴什拜羊生長性狀的一種遺傳標記。

4 結論

本研究采用PCR-SSCP和DNA測序技術對巴什拜羊A-FABP、PBDC1等基因進行遺傳多態性檢測，并與巴什拜羊的生長性狀進行相關性分析，探尋可用于巴什拜羊早期選育的分子遺傳標記，結論如下：（1）A-FABP基因外顯子2有多態性，存在2種基因型：GG和GA，測序結果顯示在A-FABP基因外顯子2的3159bp處存在G到A的突變，且該突變為同義突變。巴什拜羊的不同基因型之間體長、體重、胸圍等指標差異顯著。巴什拜羊A-FABP基因外顯子2的3159bp處表現的多態有可能作為一種遺傳標記。巴什拜羊A-FABP基因外顯子3經多態性檢測未檢測到多態性。（2）PBDC1基因在第1外顯子的170bp處發生A堿基缺失，存在2種基因型：AA型和AB型，且AB型個體的體重和體長均顯著高于AA型個體（P＜0.05），因此，可以初步推測PBDC1基因外顯子1的170bp處表現的多態性，可作為影響巴什拜羊生長性狀的一種遺傳標記。