不同燕麥品種耐鹽性差異及其生理機制

姜 瑛，周 萌，吳 越，苗玉紅，汪 強，韓燕來

(1.河南農業大學資源與環境學院，河南 鄭州 450000； 2.河南省農業科學院農業經濟與信息研究所，河南 鄭州 450008； 3.山東省土壤肥料總站，山東 濟南 250100)

目前全世界鹽堿土壤面積大約有10億hm2[1]，主要集中在歐亞大陸、非洲和北美西部，約占全球陸地總面積的25%，占可耕地面積的10%。我國鹽堿土面積約占世界鹽堿地的1/28，面積相當于我國現有耕地的1/4。我國人口眾多，人均耕地面積不足0.1 hm2，如何改良和利用好鹽漬地區的土地資源是當前面臨的重大課題。近年來，種植耐鹽植物成為鹽堿地利用和改良的重要舉措[2,3]，隨著生物技術的廣泛應用，篩選及培育耐鹽能力高的作物品種成為鹽堿地改良利用的重要方向，因而研究植物耐鹽性及其生理機制成為熱點問題之一。

燕麥(Avenasativa)是一種特殊的糧、經、飼、藥多用作物，在生態條件脆弱地區是不可替代的特色糧飼作物，主要分布在俄羅斯、美國、加拿大、德國、澳大利亞、中國和芬蘭等國[4]。我國燕麥品種資源豐富，加之從國外引進的29個物種2 099份種質資源，燕麥資源遺傳多樣性豐富，是燕麥育種的優良基礎材料[5]。燕麥具有一定耐鹽性，不同來源的燕麥抗鹽性差異顯著[6]，其在鹽堿地上的種植已成為鹽堿地改良利用的有效方式之一[7-8]。以往對于燕麥耐鹽性的研究多集中在耐鹽種質資源選育[9-10]、營養離子吸收調控[11-12]、外源物質耐鹽緩解效應機制[13-14]等方面。植物的耐鹽性是一個復雜的數量性狀，涉及諸多基因和多種耐鹽機制的協調作用，而對于燕麥耐鹽機理的研究還相對較少。

本研究對比分析了4種不同基因型燕麥在不同鹽脅迫濃度和脅迫時間下表觀指標、生理指標及Na+、K+吸收積累變化規律，對不同品種燕麥的耐鹽性進行綜合評價，并探討燕麥響應鹽脅迫的生理機制，以期為燕麥耐鹽育種和篩選提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試燕麥品種為加1(Tybor naked oat)、加8(Marion oat 2002)、加9(Nova oat 2003)和白燕6號(Baiyan 6)，其中加1、加8、加9為加拿大燕麥品種，白燕6號來自吉林白城農業科學院，以上引進品種由河南農業大學植物營養研究室在當地氣候條件下經一年的繁殖后作為供試材料。

1.2 試驗方法

本試驗在河南農業大學資源與環境學院恒溫光照培養室內進行。挑選大小均勻一致、籽粒飽滿且無病蟲害的燕麥籽粒以10%的次氯酸鈉消毒10 min，用蒸餾水沖洗干凈，25 ℃黑暗條件下浸種催芽，待種子露白后，挑選露白一致的沙盤育苗。待幼苗長至兩葉一心時，進行試驗處理。試驗采用水培法，在1/2劑量的Hoagland營養液的基礎上，設0(無鹽脅迫)、50(低鹽脅迫)、150(中鹽脅迫)和250 mmol·L-1(高鹽脅迫)4個NaCl鹽濃度水平。培養期為8 d，每2 d更換1次培養液，處理前取第1次樣，以后每2 d取1次樣，取相同部位葉片進行相關指標測定。育苗和處理時均以1/2的Hoagland營養液(約含Na+濃度3 mmol·L-1)為基礎，故在試驗開始時各供試燕麥品種有一定的Na+積累量。

1.3 指標測定方法

K+、Na+含量的提取和測定參照王寶山等[15]的方法；脯氨酸(Pro)含量測定采用茚三酮比色法；丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸反應法；葉綠素含量測定用95%乙醇黑暗條件提取24 h，并分別在波長665、649、470 nm測定吸光度。

鹽害指數：每2 d記錄一次鹽害癥狀，鹽害分級標準參照馮毓琴等[16]的方法并略有修改。0級：無鹽害癥狀；1級：輕微鹽害，植株葉片尖端萎蔫或卷曲；2級：輕度鹽害，葉片尖端萎蔫且發黃；3級：中度鹽害，植株生長發育受抑制，約1/3的葉片焦枯發黃；4級：重度鹽害，植株生長發育嚴重受抑制，葉色整體變淺綠色，近1/2的葉片焦枯變黃；5級：極重度鹽害，植株葉片焦枯，萎蔫死亡。

鹽害指數=[∑(鹽害級值×相應鹽害級值株數)/(總株數×鹽害最高級值)] ×100%。

1.4 抗鹽性評價方法

采用模糊數學中的隸屬函數值法[16-17]對各燕麥品種抗鹽性差異進行綜合評價。

1.5 數據處理

本試驗采用SPSS 18.0進行相關分析統計，用Duncan法以及LSD法進行數據的方差分析(P<0.05)；運用Origin 8.5和Office 2016進行相關圖表的制作。

2 結果與分析

2.1 不同燕麥品種鹽害指數

各燕麥品種在空白和低鹽濃度下生長發育正常，沒有鹽害表現。而隨著鹽濃度的增加，鹽害指數不斷提高，鹽害程度逐漸增大，且隨著鹽脅迫時間的延長，鹽害程度也隨之增大，但不同品種鹽害指數對鹽脅迫反應有所差異(表1)。

在中鹽濃度下，加1和加9在脅迫2 d時開始表現輕度鹽害癥狀，且隨著脅迫時間的延長，兩品種鹽害的癥狀加劇，第6天和第8天時，多數植株鹽害嚴重；加8和白燕6號在脅迫4 d時開始出現鹽害癥狀，白燕6號在脅迫第6天時出現較明顯的中度鹽害，加8在脅迫第8天時半數植株表現為中度鹽害。在高鹽濃度下，加1和加9在脅迫第2天有明顯的鹽害癥狀，在脅迫第4天，鹽害加劇，在第6天時鹽害嚴重，多數植株生長發育嚴重受抑制，脅迫第8天植株全部死亡。而加8和白燕6號在脅迫4 d開始表現明顯的鹽害，隨著脅迫時間的延長，兩品種出現鹽害癥狀的植株逐漸增多，以白燕6號的鹽害癥狀較明顯。比較4個燕麥品種的鹽害情況，加8對鹽分脅迫較不敏感，白燕6號居中，加1和加9對鹽害較為敏感。

表1 鹽脅迫濃度和時間對不同品種燕麥鹽害指數的影響Table 1 Effect of salt stress time and concentration on oats salt injury index

2.2 鹽脅迫對不同品種燕麥幼苗葉片葉綠素含量的影響

隨著鹽濃度的增加和脅迫時間的延長，葉綠素含量整體呈下降趨勢(圖1)。與對照相比，各燕麥品種葉綠素含量在低鹽濃度下葉綠素含量總體上呈上升趨勢，品種間變化趨勢略有不同，其中加8葉綠素含量總體上增加9%，為4個品種增幅最大的，其他3個品種葉綠素含量增加幅度不大，范圍為1%～4%。在中鹽濃度下，加1和加9隨著脅迫時間的延長，葉綠素含量下降趨勢明顯，脅迫8 d兩品種葉綠素含量分別降低了29.12%、26.45%。而加8和白燕6號隨脅迫時間延長，葉綠素含量呈現先降低后上升最后降低的波動變化趨勢，在脅迫2 d時葉綠素含量均有所降低，而后隨著脅迫時間延長，脅迫4 d時，葉綠素含量略有升高，白燕6號在脅迫6和8 d時含量逐漸降低，較對照分別降低4.09%和7.60%，加8則在脅迫8 d時含量降低，降低了6.52%。在高鹽濃度下，隨著脅迫時間的延長，各燕麥品種葉綠素含量均呈下降趨勢，大致上以加1降低幅度最大，而加8降低幅度最小。

圖1 各品種燕麥在不同鹽濃度和脅迫時間處理下葉綠素含量Fig. 1 Effect of salt stress time and concentration on chlorophyll content in different oats

同一處理時間不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Different lowercase letters within the same time indicate significant difference at 0.05 level; similarly for the following figures．

2.3 鹽脅迫對不同品種燕麥丙二醛含量的影響

隨著鹽濃度的升高及脅迫時間的延長，所有燕麥品種幼苗葉片丙二醛含量大體呈逐漸升高的趨勢(圖2)，不同品種間丙二醛積累趨勢有所差異。與對照相比，隨著脅迫時間的延長，加1、加9丙二醛含量呈先增高后降低的趨勢，而加8、白燕6號丙二醛含量低于前兩個品種，且隨脅迫時間延長逐漸趨于穩定，其中白燕6號在脅迫初期各鹽濃度脅迫處理間差異不大。在中鹽和高鹽脅迫下，隨著脅迫時間的延長，各燕麥品種丙二醛含量基本呈上升趨勢，在鹽脅迫2 d時丙二醛含量有較快的上升趨勢，脅迫4和6 d時丙二醛含量上升趨勢漸緩，中鹽脅迫8 d時丙二醛含量較第6天大量增加，可見植株自身的適應調控機制難以抵抗持續的鹽脅迫傷害，正常的生理機能受到影響，正常生長受抑制，高鹽脅迫8 d時，大量植株已不能抵抗高鹽濃度傷害，植株生長嚴重受影響甚至死亡。在各鹽濃度條件下，加1和加9丙二醛含量均高于加8和白燕6號。由此可見，在不同濃度鹽處理下，相比加8和白燕6號，加1和加9對鹽脅迫更敏感。

圖2 各品種燕麥在不同鹽濃度和脅迫時間處理下丙二醛含量Fig. 2 Effect of different salt concentrations and stress time on malonaldehyde content of different oats

2.4 鹽脅迫對不同品種燕麥脯氨酸含量的影響

脯氨酸是在細胞中起著滲透調節作用的細胞相溶性物質，它被廣泛的積累在各器官中[18]。鹽分脅迫下，植物通過脯氨酸的合成和離子吸收降低細胞的水勢，同時在高滲溶液中加強水分吸收[19]。鹽脅迫下各燕麥品種脯氨酸積累情況如圖3所示，各燕麥品種不同鹽濃度處理間脯氨酸積累變化有所差異，隨脅迫時間的延長，低鹽濃度處理下各品種脯氨酸含量變化不大，中鹽處理下，加1、加8和加9脯氨酸含量不斷累積，而白燕6號脯氨酸含量在第2天與其他品種相比即有較快的積累增長趨勢，隨著時間的延長，處于相對穩定并逐步累積的狀態，在脅迫第8天又快速積累，所有品種在脅迫處理第8天時達到最高值，脯氨酸含量以加8最高，白燕6號次之，加9，加1最低。高鹽處理下，各品種間脯氨酸積累變化趨勢不一致，加1和加9隨著脅迫時間的延長，脯氨酸含量呈現先增加后降低的趨勢，而加8和白燕6號脯氨酸含量則是不斷積累，但增速降低，在脅迫第8天，與中鹽脅迫處理間相差不大，脯氨酸含量趨于穩定。

2.5 不同鹽濃度對燕麥品種Na+、K+吸收的影響

隨著鹽脅迫濃度的提高和鹽脅迫時間的延長，所有供試燕麥品種地上部葉片中Na+含量總體呈逐漸增加的趨勢(圖4)，K+含量呈逐漸降低的趨勢(圖5)，不同品種間Na+、K+含量及K+/Na+值變化趨勢(圖6)稍有不同。在低、中鹽脅迫下，各個脅迫時間段內加8體內的Na+含量均低于其他3個燕麥品種，K+含量明顯高于其他3個燕麥品種，由于加8較低的Na+吸收和較高的K+吸收，導致其K+/Na+均明顯高于其他3個燕麥品種。與其他品種相比較，白燕6號在低、中鹽脅迫條件下Na+含量相對較高，并且具有較低的K+吸收能力，表現出較低的K+/Na+值。在高鹽脅迫下，隨著脅迫時間的延長，加8和白燕6號對Na+吸收仍保持繼續增加的趨勢，其中加8的持K+能力在前期具有明顯的優勢，到后期優勢減弱，但仍高于其他品種，總體上加8的K+/Na+在脅迫各時期均為最高值。

圖3 不同鹽濃度和脅迫時間處理對各品種燕麥脯氨酸含量的影響Fig. 3 Effect of different salt concentrations and stress time on proline content of different oats

圖4 燕麥地上部葉片中Na+含量Fig. 4 Content of Na+ in the leaves aboveground

圖5 燕麥地上部葉片中K+含量Fig. 5 Content of K+ in the leaves aboveground

圖6 燕麥地上部葉片中K+/Na+比例Fig. 6 Ratios of K+/Na+ in the leaves aboveground

2.6 不同品種燕麥耐鹽性綜合評價

通過對以上指標結果進行分析，計算得出各指標的耐鹽隸屬函數值(表2)。脯氨酸在低鹽脅迫下和中、高鹽脅迫下的含量積累結果不能說明其與作物的耐鹽性存在一致的正相關或負相關關系，此外，鹽脅迫下耐鹽表現較好的品種Na+含量偏高或許與該品種耐鹽類型和耐鹽閾值有關，在此不作綜合評價分析。

對照表2數據，在對照和低鹽脅迫下，各品種隸屬函數平均值差異不大，隨著鹽濃度的升高，品種之間的差異逐漸增大，在中鹽和高鹽脅迫下差異達到最大值。在各個鹽濃度下，品種加8和白燕6號隸屬函數平均值較高，加1和加9隸屬函數平均值較低，總體上以加8耐鹽性最好，加1耐鹽性最弱。

表2 不同品種燕麥指標隸屬函數值及耐鹽綜合評價Table 2 Subordinate function values of the indexes and comprehensive evaluation of salt stress on different oats

3 討論與結論

本研究作物表觀鹽害表現結果顯示，加8和白燕6號鹽害癥狀相對較輕，而加1和加9在高鹽脅迫初期開始就表現明顯的鹽害癥狀。不同燕麥品種對鹽脅迫的適應性差異在葉綠素含量上也有具體的表現，在中鹽濃度條件下，隨脅迫時間的延長，加8和白燕6號葉綠素呈先降低后上升最后降低的波動變化趨勢，而加1和加9葉綠素含量則不斷降低，在高鹽濃度下，隨著鹽脅迫的加劇，各燕麥品種葉綠素含量均呈下降趨勢，前兩個品種比后兩個品種葉綠素含量降低幅度要小。各品種葉綠素含量降低，說明鹽脅迫對燕麥植株的光合抑制，鹽脅迫一方面可通過減少水勢抑制光合作用，另一方面，在高鹽濃度下，高濃度的Na+誘導葉綠素酶活性提高，從而加速葉綠素被降解，促使其含量降低[20]。同時高鹽濃度下，細胞內離子含量穩定性發生變化，葉綠素和葉綠體之間的連接都是松散的，葉綠素易被破壞[21]。加8和白燕6號葉綠素含量在降低后又出現上升的現象說明，在植株遭受鹽脅迫初期，葉片葉綠素和葉綠體膜蛋白含量受到影響出現短暫的降低，植株通過耐鹽機制調節自身耐鹽適應性，緩和鹽脅迫傷害，保持正常生長和光合作用，則葉綠素含量會有短暫的上升現象。一些植物通過增加水利用效率實現耐鹽途徑，如冰葉日中花(Mesembryanthemumcrystallinum，它們把光合作用模式從C3轉換到CAM模式，在長期鹽分存在的條件下，植物會在晚上張開氣孔，進而減少蒸騰水損失[22]。濱藜(Atriplexlentiformis)在鹽脅迫情況下可將光合作用模式從C3路徑轉換到C4路徑[23]。

在鹽漬化土壤中，Na+是造成植物傷害的重要因素。鹽脅迫下，大量Na+流入細胞可以導致細胞膜去極化，從而誘導K+外流，活性氧代謝系統的動態平衡遭到破壞，膜脂過氧化或膜蛋白過氧化作用造成膜質或膜蛋白損失，導致植物細胞的正常生理功能發生紊亂，甚至傷害死亡[24]。對許多植物來說，如果Na+的毒性是由于Na+利用K+吸收途徑并通過競爭K+的結合位點進入植物體內造成的，則維持高的K+/Na+比簡單地維持低的Na+濃度更有意義[25]。如大麥(Hordeumvulgare)通過調節H+泵的傳輸驅動力和K+和Na+的表達和活性，使細胞溶質中維持了K+高鹽和Na+低鹽[26]。本研究中，隨著鹽脅迫程度的加劇，加8對Na+的吸收及K+/Na+較穩定，尤其是在鹽脅迫下有著較強的持K+能力，能夠保持較高的K+/Na+，加8的耐鹽性表現也驗證了以上觀點；加1和加9對Na+的吸收及K+/Na+易受到鹽濃度及脅迫時間的影響，耐鹽性相對較弱。

游離脯氨酸在細胞內的積累對于降低細胞內溶質的滲透勢、均衡原生質體內外的滲透強度、維持細胞內酶正常的結構和構象、減少細胞內可溶性蛋白的沉淀等具有重要的作用。在鹽漬條件下植物細胞中吸收和積累大量的鹽分，其中大部分鹽離子被區隔化在液泡中，因此液泡本身的水勢很低，造成細胞質脫水。在此情況下細胞質合成一定數量的脯氨酸和其他可溶性有機物質，增大細胞質濃度，平衡液泡和細胞質的水勢，防止液泡從細胞質中吸水，避免細胞質受到影響。Cuin和Shabala[27]研究表明鹽脅迫下脯氨酸的積累不僅僅是植物受到鹽脅迫的一個癥狀，它可以通過提高蛋白和膜的穩定性來緩解細胞的傷害，減緩NaCl誘導K+外流，這對保持細胞質高的K+/Na+，從而提高植物的耐鹽性非常關鍵。小麥(Triticumaestivum)受NaCl脅迫時，植株內大部分氨基酸濃度會隨著鹽脅迫的誘導而增加，脯氨酸增幅尤為顯著[28]。本研究中，在高鹽脅迫下，加8和白燕6號的脯氨酸含量不斷累積，而加1和加9脯氨酸含量達到最高值后分別在脅迫第8天和第6天開始降低，說明加1和加9在高鹽處理下，隨著鹽脅迫時間的延長，細胞主動調節滲透勢和維持膜穩定性的適應能力下降，細胞受到鹽脅迫的傷害，這一推測在本研究中兩個品種在高鹽濃度下丙二醛含量明顯升高的結論中得到驗證。

丙二醛是植物細胞膜脂過氧化自由基鏈式反應中產生的膜脂內過氧化物進一步降解的產物[29]，逆境條件下植物往往會發生膜脂過氧化傷害。丙二醛的含量高低是反映細胞膜脂過氧化作用強弱和質膜破壞程度大小的重要指標，丙二醛含量越高，質膜受到的傷害也越大[30]。Al-Quraan[31]和Chaves等[32]研究表明，隨著外界脅迫時間的延長，植物MDA含量有所下降，這可能是因為低鹽濃度下，植物鹽脅迫程度低，在脅迫一段時間后植物開啟自身的滲透調節保護機制減輕鹽脅迫的影響，植株能夠繼續正常生長，生物量有所增長，從而使MDA含量有所降低。加8和白燕6號相對加1和加9有著較低的MDA含量值，可見前兩個品種有著較強的鹽脅迫適應能力，受到鹽脅迫的傷害相對較小，這點在二者表觀鹽害表現和較高的葉綠素含量得到了印證，與Mansour[33]和Ashraf和Ali[34]認為質膜透性增加及增加幅度與品種耐鹽性呈負相關的研究結果相一致。

由此可見，脯氨酸、丙二醛的積累規律與品種的耐鹽能力具有相關性，鹽脅迫下脯氨酸、丙二醛的積累可作為品種是否耐鹽的判定指標，這與前人研究結果相一致[35-37]。

耐鹽植物通過諸多生物化學和分子機制應對外界鹽脅迫，如選擇性積聚或釋放離子、控制離子從根部到葉片的運輸、合成相溶性物質、改變光合作用途徑、改變膜結構、誘導抗氧化酶、植物激素等的產生。不同作物、不同品種之間機理不同、作用強度不同，導致作物耐鹽性差異[38]。本研究不同鹽濃度處理下耐鹽隸屬函數值結果可知，品種加8和白燕6號隸屬函數平均值較高，加1和加9隸屬函數平均值較低，隨著鹽濃度的升高，品種之間的差異逐漸增大，在中、高鹽脅迫下差異達到最大值反映出前兩者具有較高的耐鹽性，而后兩者屬于耐鹽相對敏感品種，品種間耐鹽性由強到弱排列為加8>白燕6號>加9>加1。

植物復雜耐鹽機制涉及植物在受到鹽脅迫時的主要生理變化過程，主要目的是保護光合作用、呼吸作用、水利用效率和維持一些重要的植物特征(如細胞架、細胞壁、質膜—細胞壁間的交互作用)、染色體和染色質結構的改變(DNA甲基化、染色體增倍，特定次序的改變或DNA消除)等。本研究中加8和白燕6號雖然較其他兩個品種較耐鹽，但兩個品種間還是存在不同的耐鹽表現。加8對Na+的吸收及K+/Na+較穩定，尤其是在鹽脅迫下有著較強的持K+能力，能夠保持較高的K+/Na+，這或許是加8耐鹽性高于其他品種的主要原因。在脯氨酸積累方面，白燕6號對于中鹽脅迫能快速啟動調節機制，大量增加脯氨酸含量，維持細胞質膜穩定性，減少膜脂過氧化傷害，在鹽脅迫初期不同鹽濃度處理下白燕6號丙二醛含量較低并維持穩定的結果也證明了這一觀點。白燕6號在Na+、K+吸收方面，白燕6號相比于加8 Na+含量較高，而K+含量明顯不及加8，可能與其在Na+區隔化或脯氨酸滲透調節能力具有一定的優勢有關。

隨著植物耐鹽途徑及耐鹽機理的不斷研究，目前通過植物分子學已鑒定出了一些由鹽脅迫誘導的基因[39-40]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)在鹽脅迫和脫落酸作用下，耐鹽性基因AtNHX1基因的轉錄本為上調，說明NaCl、KCl或脫落酸能促進AtNHX1啟動因子[41]。同樣在鹽脅迫轉錄下，諸多研究從分子角度驗證了耐鹽機理[42-43]。耐鹽性具有多基因支配特征，不同功能組的基因共同參與編碼鹽脅迫蛋白質，包括光合作用酶基因、相溶性物質合成基因、液泡酶基因和清除活性離子酶基因等，大部分基因在功能組上被劃分為鹽脅迫下的鹽誘導基因。但是當前對鹽誘導基因認識仍然不足，需要進一步加強研究。