Ku70對HTLV-1陽性T細胞中HTLV-1病毒蛋白表達的影響*

宋 迪， 馬玲玲， 郭志祥， 劉 月， 崔鈺晗， 關宇鶴， 楊 波， 王 潔

(新鄉醫學院河南省免疫與靶向藥物重點實驗室， 醫學檢驗學院科研創新班， 河南省分子診斷與醫學檢驗技術協同創新中心， 河南 新鄉 453003)

人嗜T淋巴細胞病毒1(human T-lymphotrophic virus 1，HTLV-1)是一種與人類疾病相關的逆轉錄病毒，由其感染引發的成人T細胞白血病(adult T-cell leukemia，ATL)和HTLV-1相關性脊髓病/熱帶痙攣性輕截癱(HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis，HAM/TSP)目前還沒有有效的治療手段[1]。HTLV-1在人體內潛伏期很長，可達20年以上，約有5%的攜帶者可發展成ATL患者。ATL是一種CD4+T淋巴細胞惡性增殖性腫瘤，急性ATL患者的平均存活期一般不超過 1 年，然而目前對于該病毒如何逃逸宿主的免疫監視并引發疾病的病理機制還所知甚少[2-3]。研究表明，在固有免疫細胞中，Ku70可由HTLV-1感染誘導表達，Ku70可識別HTLV-1的反轉中間體并通過激活固有免疫應答反應來抑制HTLV-1的復制[4]。值得注意的是，HTLV-1主要感染的是T淋巴細胞，而Ku70在T淋巴細胞中的功能并不清楚。本研究通過在HTLV-1陽性的T淋巴細胞系中沉默Ku70的表達，觀察細胞中HTLV-1病毒蛋白表達及干擾素(interferon, IFN)和促炎因子的產生情況。

材 料 和 方 法

1 細胞培養

Jurkat、MT2、 MT4及C8166細胞均使用RPMI-1640培養液，含10%的胎牛血清、4 mmol/L的L-谷氨酰胺、1×105U/L的青霉素及100 mg/L的鏈霉素，在37 ℃的細胞培養箱中通入5%的CO2懸浮培養。

2 主要試劑

抗β-actin抗體購自Proteintech，貨號為60008-1；抗HTLV-1病毒蛋白Tax抗體購自Santa Cruz Biotechnology，貨號為sc-57872；抗Ku70和抗HTLV-1病毒蛋白p19抗體購自Abcam，貨號分別為ab83501和ab9080；HRP標記的山羊抗兔 II 抗和HRP標記的山羊抗小鼠 II 抗均購自Proteintech，貨號分別為SA00001-2和SA00001-1；轉染試劑Lipofectamine 2000 購自Invitrogen；細胞培養液和胎牛血清均購自Gibco；其它常用生化試劑均為進口分裝。所用引物由金唯智生物科技有限公司根據設計合成，見表1。

3 主要方法

3.1RNA干擾 靶向Ku70的siRNA(siRNA-Ku70, SK)購自Invitrogen，正義鏈的序列為5’-GACAUAUCCUUGUUCUACATT-3’，反義鏈的序列為5’-UGUAGAACAAGGAUAUGUCAA-3’； 陰性對照siRNA(siRNA-control, SC)同樣購自Invitrogen，貨號為No. 4390843。SK和SC均采用Lipofectamine 2000分別轉染入MT2細胞和MT4細胞中：將5×105的MT2細胞和MT4細胞鋪于無血清無雙抗的Opti-MEM培養液中，轉染入2 μg的SK和SC，6 h后補充新鮮含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液，24 h后收獲細胞進行real-time PCR和Western blot檢測。

表1 引物序列

3.2Real-time PCR 細胞中總RNA的抽提使用Invitrogen的TRIzol試劑，并嚴格按照配套的操作手冊進行?；蜣D錄本的擴增使用Applied Biosystems的7500 Fast Real-Time PCR System， PCR程序為： 95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s, 40個循環； 72 ℃ 5 min?；蛳鄬Ρ磉_量采用2-ΔΔCt法計算。

3.3Western blot實驗 收集細胞后，提取各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，行SDS-PAGE,電泳后轉膜將蛋白樣品轉移到硝酸纖維素膜上。轉膜結束后用TBST洗膜1次，用5%脫脂奶粉封閉膜1 h，用TBST洗膜1次，將稀釋后的I抗與膜室溫雜交2 h或4 ℃過夜。用TBST洗滌3次后將稀釋后的II抗與膜室溫雜交1 h，用TBST洗滌后加入底物顯色，曝光。

4 統計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，實驗結果用3次獨立實驗的均數±標準差(mean±SD)表示，用獨立樣品t檢驗比較兩組間的差異，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 HTLV-1陽性T細胞中Ku70表達上升

HTLV-1陽性T細胞系(C8166、MT2及MT4)和HTLV-1陰性T細胞系Jurkat計取相同的細胞數，裂解后進行Western blot檢測,結果顯示,與HTLV-1陰性T細胞系Jurkat相比，HTLV-1陽性T細胞系不管是C8166、MT2還是MT4，Ku70蛋白的表達均明顯上調(P<0.05或P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The expression of Ku70 in HTLV-1 positive T cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs Jurkat.

2 針對Ku70的siRNA可以有效抑制Ku70的表達

Western blot檢測發現，SK可明顯抑制MT2細胞中Ku70的表達(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The effect of Ku70-specific siRNA on Ku70 expression in MT2 cells. SC: control siRNA; SK: Ku70-specific siRNA. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs SC group.

3 MT2細胞中基因沉默Ku70后HTLV-1相關蛋白的表達升高

在MT2細胞中，與對照組(轉染SC組)相比，沉默Ku70組(轉染SK組)HTLV-1相關蛋白Tax、p19和Env的mRNA和蛋白水平均明顯升高(P<0.01)，見圖3、4。

Figure 3.The effect of Ku70 knockdown on HTLV-1-related protein expression at mRNA levels in the MT2 cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs SC group.

4 MT4細胞中基因沉默Ku70后HTLV-1相關蛋白的表達升高

在MT4細胞中，與對照組(轉染SC組)相比，沉默Ku70組(轉染SK組)HTLV-1相關蛋白在mRNA和蛋白水平上的表達均明顯升高(P<0.01)，見圖5、6。

5 MT2細胞中基因沉默Ku70后抗病毒細胞因子表達降低

在MT2細胞中，與對照組(轉染SC組)相比，沉默Ku70組(轉染SK組)中抗病毒感染細胞因子IFN-α、IFN-γ及TNF-α的量明顯降低(P<0.01)，見圖7。

6 MT4細胞中基因沉默Ku70后抗病毒細胞因子表達降低

在MT4細胞中，與對照組(轉染SC組)相比，沉默Ku70組(轉染SK組)中抗病毒感染細胞因子IFN-α、IFN-γ及TNF-α的量明顯降低(P<0.01)，見圖8。

Figure 4.The effect of Ku70 knockdown on HTLV-1-related protein expression in the MT2 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs SC group.

Figure 5.The effect of Ku70 knockdown on HTLV-1-related protein expression at mRNA levels in the MT4 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs SC group.

Figure 6.The effect of Ku70 knockdown on HTLV-1-related protein expression at protein levels in MT4 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs SC group.

Figure 7.The effect of Ku70 knockdown on anti-viral responses in MT2 cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs SC group.

Figure 8.The effect of Ku70 knockdown on anti-viral responses in the MT4 cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs SC group.

討 論

1 Ku70在HTLV-1復制中的功能

Ku70在進化上相對保守，在真核生物中普遍存在。Ku70可與Ku80以及催化亞基DNA-PKcs形成復合物DNA-PK，在雙鏈DNA缺口修復中發揮重要功能[5-6]。值得注意的是，細胞內Ku70的表達量比DNA-PKcs高很多[7]，提示Ku70很可能還具有其它的功能。在逆轉錄病毒感染過程中，Ku70的功能存在爭議。有報道稱Ku70可以與HIV-1的整合酶結合并保護其不受降解，從而有利于HIV-1的復制[8];然而也有研究者發現Ku復合物抑制HIV-1的轉錄表達[9]。而我們之前的研究表明Ku70可識別HTLV-1的反轉中間體，通過激活抗病毒固有免疫應答反應來抑制HTLV-1的復制[4]。這些報道提示我們在逆轉錄病毒感染過程中，Ku70的角色復雜，可能跟病毒類型、細胞類型以及感染階段等多種因素相關，需要在不同病毒不同細胞中具體研究。

我們首先確認了Ku70在HTLV-1陽性T細胞中的表達水平，結果發現在MT2、MT4以及C8166等多種HTLV-1陽性T細胞系中Ku70均有表達，且表達水平高于HTLV-1陰性T細胞系Jurkat,這提示我們Ku70與HTLV-1感染具有一定的相關性。那么在HTLV-1感染的T細胞中，這種上調的Ku70的表達究竟具有什么功能呢？據此本研究采用RNA干擾技術在HTLV-1陽性T細胞中基因沉默Ku70，研究在HTLV-1陽性T細胞中的功能。為了排除細胞特異性的影響，我們在MT2和MT4這兩種不同的HTLV-1陽性T細胞系中研究了Ku70的功能。利用siRNA沉默Ku70后，我們發現不管是在MT2還是MT4細胞中，不管是在蛋白水平還是在mRNA水平, HTLV-1病毒蛋白的表達都有明顯提高，提示我們Ku70可能具有抑制HTLV-1病毒復制的功能。

2 Ku70與抗病毒細胞因子的表達

病毒感染宿主細胞后，可激活一系列的抗病毒免疫應答反應，包括干擾素和促炎因子等多種細胞因子的表達，這些細胞因子的表達在適應性免疫應答反應中具有重要作用，有利于機體對抗病毒感染，并達到清除病毒的目的[10-11]。關于Ku70在T細胞中的角色，之前的報道多是從DNA修復的角度研究，那么在HTLV-1陽性T細胞中，Ku70是否有其它作用機制呢？HTLV-1陽性T細胞源自Th細胞，與Th細胞，尤其是Th1細胞具有相似的細胞因子表達譜，如TNF-α以及IFN-γ等[12]。另外，在HTLV-1陽性T細胞中，IFN-α也是表達的[13]。有研究顯示，在固有免疫應答反應中，Ku70可以作為DNA識別受體來激活干擾素和促炎因子的表達[14-15]，但是在T細胞中，Ku70對細胞因子的表達是否有調控作用，目前并不清楚。

據此本研究關注了Ku70對HTLV-1陽性T細胞中細胞因子的表達的影響。我們采用RNA干擾技術在MT2細胞和MT4細胞中沉默Ku70的表達，檢測相關細胞因子的表達。我們發現在MT2細胞和MT4細胞中IFN-α和TNF-α均有高表達，而沉默Ku70后，這些細胞因子的表達均有明顯的降低，提示我們Ku70可能具有促進IFN-α和TNF-α等細胞因子表達的功能。值得注意的是，沉默Ku70后，主要由T細胞分泌產生的細胞因子IFN-γ也有明顯降低，而以前并沒有關于Ku70對IFN-γ表達調控的報道。在 HTLV-1 陽性 T 細胞中， Ku70 本身是通過什么機制上調的，又是如何調控這些細胞因子的表達的，目前還不清楚，值得進一步深入研究。另外，HTLV-1病毒在人體內可長期穩定存在，說明HTLV-1病毒已建立起一套逃逸免疫監視的機制，在HTLV-1陽性T細胞中，病毒如何逃逸Ku70的抗病毒作用，是又一值得關注的問題。

綜上所述，本研究利用RNA干擾技術在HTLV-1陽性T細胞中沉默Ku70的表達，揭示沉默Ku70促進了HTLV-1病毒蛋白的表達且抑制了IFN-α、IFN-γ及TNF-α的產生，提示Ku70在HTLV-1陽性T細胞系中可能具有通過促進抗病毒細胞因子表達來調控HTLV-1復制的功能。