抑制外泌體釋放對骨髓間充質干細胞生物學特性的影響*

郭貴顯， 成傳訪▲， 顧杰蕾， 周文怡， 湯曉燕， 鐘 赟, 陳顏芳, 2， 劉世明△

(1廣州醫科大學附屬第二醫院心內科， 廣州心血管疾病研究所， 廣東 廣州 510260； 2萊特州立大學Boonshoft醫學院藥理學與毒理學系， 美國 俄亥俄州 代頓 45435)

缺血性心臟病是嚴重威脅人類健康的疾病之一。由于心臟內源性修復機制有限，心肌缺血梗死后引起心肌細胞的永久性缺失，導致局部纖維瘢痕的形成，從而導致左室重構，最終引起心力衰竭。對于缺血性心臟病的治療現階段主要有藥物治療、介入治療及手術治療，但這些方法都有一定的局限性，使治療效果不能令人十分滿意。近年興起的細胞移植新方法對未來治療心血管疾病具有重要的應用價值?，F已有多種細胞尤其是干細胞用于治療心肌梗死的研究，骨髓間充質干細胞作為細胞移植治療的種子細胞，具有取材方便、免疫原性低、不受倫理學限制、容易進行自體移植等諸多優點[1]。

移植的間充質干細胞到達心肌梗死部位后在局部產生多種生物學效應，除了增殖分化為血管內皮細胞及少量分化為心肌樣細胞外，還能通過旁分泌的方式產生大量的促血管生成因子等保護性細胞因子，改善缺血心肌的血液供應或心肌代謝，以此來參與心臟組織的重建，從而改善心肌梗死后心功能[2]。盡管如此，移植的間充質干細胞在缺血微環境中的存活率限制了干細胞的治療效果，近年來間充質干細胞到達心肌缺血部位后釋放到大量具有心肌保護效應的外泌體備受關注[3]。

外泌體是一種納米級的小囊泡，其能攜帶大量生物學信號并參與細胞間的生物信息交流，外泌體從細胞內釋放到胞外的過程主要由一些小G蛋白協助完成，其中Rab27a是調節外泌體釋放的重要因子之一，其主要功能是將多囊泡體運載至細胞膜相應部位，使得多囊體與細胞膜融合而釋放外泌體[4]。移植的間充質干細胞在心梗部位釋放大量的外泌體從而發揮心肌保護效應[5]，但目前對于外泌體缺失對間充質干細胞生物學特性的影響尚未有詳細的報道。因此本文通過敲除Rab27a來抑制骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSCs)外泌體的釋放，隨后對抑制外泌體釋放的間充質干細胞的增殖能力及缺氧耐受能力做初步的研究。

材 料 和 方 法

1 動物

SPF級C57BL/6J小鼠，雌雄不限，6～8周齡，18～20 g，由廣東省實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(粵)2013-0002。BM-MSCs由小鼠股骨及脛骨中分離提取。

2 主要試劑

IMEM液體培養基和胎牛血清購自Gibco；外泌體提取試劑盒購自Invitrogen；EdU試劑盒(Cell-LightTMEdU Apollo 567 In Vitro Kit)購自廣州銳博生物科技有限公司；MTS購自Promega；抗Rab27a抗體(SC-22756)購自Santa Cruz；抗增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗體(CST 2586S)及抗GADPH抗體(CST 2118L)購自CST；抗CD63抗體(ab8219)購自Abcam；其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。所用引物由上海吉凱基因技術有限公司根據設計合成。

3 主要方法

3.1TALEN技術構建Rab27a基因敲除模型 根據NCBI上Rab27a基因的序列，利用TALEN(transcription activator-like effector nucleases)在線設計工具(http://zifit.Partners.org/ZiFiT/Choice Menu.aspx)設計基因敲除位點，并構建相關載體，隨后將Rab27a的TALEN-L mRNA 和 TALEN-R mRNA 混合在一起后以第2個外顯子作為靶點在顯微鏡下利用顯微操作系統注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，隨后移植到ICR受體雌鼠體內，具體實驗方法參考小鼠胚胎操作實驗手冊[6]。該過程與賽業(廣州)生物科技有限公司共同完成。隨后取3周齡小鼠鼠尾用堿裂解法提取基因組 DNA并檢測其基因序列(上游測序引物Rab27a-F的序列為5’-ACCAGCTCTAATTCTCGATTCCTGG-3’,下游測序引物Rab27a-R的序列為5’-GGCTTCTCAAGTCCGGTTAATTTGT-3’)，按照活性鑒定方法對 F0 代小鼠進行鑒定，以此來挑選敲除Rab27a的純合子小鼠。

3.2間充質干細胞的分離、培養及鑒定 按照全骨髓法提取間充質干細胞[7]。取敲除Rab27a的純合子小鼠(knockout, KO)及野生型(wild-type,WT)小鼠兩側股骨及脛骨，去除兩端用1 mL注射器沖出骨髓腔內骨髓細胞，隨后1 000 r/min離心5 min，棄上清，用PBS洗滌細胞2次，最終用含10% 胎牛血清的IMDM培養基將細胞重懸，并接種到25 cm2培養瓶中，37 ℃、5% CO2培養箱中連續培養。48 h后首次換液，并用PBS清洗2次，同時在顯微鏡下觀察細胞密度及形態。待細胞密度到達80%～90%后按1∶2傳代，傳至第3代用于后續實驗,隨后取第3代骨髓間充質干細胞，常規消化、重懸；取流式細胞儀專用試管4個，每管加入100 μL細胞懸液，加入小鼠抗人Sca-1 APC-A、CD34 PE-A、CD44 FITC-A和CD45 PE-Cy7-A熒光單克隆抗體各5 μL，4 ℃孵育15 min，用流式細胞儀進行測定。

3.3外泌體的提取及鑒定 KO-MSCs和WT-MSCs分別用0.25%的胰酶消化后用IMDM完全培養基將細胞重懸至1×1010/L，并接種在6孔板中，培養2 d后，棄培養基換用2 mL去除外泌體的10%胎牛血清的IMDM 培養基在培養箱中培養，48 h后收集上清，細胞用4%多聚甲醛固定15 min后加入1 mL結晶紫染色液， 15 min后在顯微鏡下拍照并進行細胞計數。將收集的細胞培養基于4 ℃、2 000×g離心30 min以去除細胞及細胞碎片。收集上清液加入1 mL外泌體提取試劑，渦旋混勻后4 ℃孵育過夜，之后于4 ℃、10 000×g離心1 h。棄上清，用100 μL去外泌體的PBS重懸，利用納米顆粒跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis， NTA)對外泌體進行計數，同時將20 μL外泌體混勻滴于銅網表面，室溫靜置1 min，用濾紙吸干液體；滴加適量磷鎢酸室溫復染5 min，用濾紙從側面小心吸干復染液后置于電鏡下觀察外泌體大小和形態;最后通過Western blot檢測外泌體標志性蛋白CD63的表達。

3.4MTS實驗檢測細胞活力 KO-MSCs和WT-MSCs分別用0.25%的胰酶消化后，用IMDM完全培養基將細胞重懸，以1×106cells/L的密度接種至96孔板中，每組設置5個復孔，培養2 d后加入100 μL含不同濃度(0、25、50、100、200和400 μmol/L)H2O2培養基培養箱內繼續培養6 h。培養結束后棄上清液加入100 μL含有20 μL MTS的培養基，于培養箱中避光孵育3 h后在酶標儀上測定490 nm時各孔的吸光度(A)值。

3.5TUNEL實驗檢測細胞凋亡 KO-MSCs及WT-MSCs分別消化后重懸，以1×106cells/L的密度接種至96孔板中，每組設置4個復孔，培養2 d后棄培養基每孔加入含有100 μmol/L H2O2的IMDM培養基，培養箱中孵育6 h，培養結束后棄上清并用PBS清洗2遍，用4%多聚甲醛室溫固定25 min，PBS清洗2～3遍后用100 μL 0.5% Triton X-100室溫靜置5 min，棄通透液加入100 μL平衡緩沖液室溫靜置5～10 min。棄平衡液后加入50 μL rTdT，37 ℃避光孵育60 min，棄孵育buffer并每孔加入100 μL 2×SSC溶液，室溫孵育5 min，棄孵育buffer并用PBS清洗2～3次，隨后加入DAPI染液，室溫孵育15～20 min，棄染色液用PBS清洗2～3遍后在倒置熒光顯微鏡觀察拍照。

3.6EdU實驗檢測細胞增殖 采用上述相同的方法將KO-MSCs和WT-MSCs分別接種在96孔板中，每組設置6個復孔，培養2 d后每孔加入含50 μmol/L EdU培養基共孵育4 h，用PBS清洗細胞2次后，用4%多聚甲醛固定細胞30 min。棄固定液PBS清洗細胞2次，加入100 μL 2 g/L的甘氨酸中和殘留多聚甲醛，棄甘氨酸后PBS清洗細胞2次，每孔加入100 μL 0.5% Triton X-100(PBS配制)孵育10 min，PBS清洗細胞2次后加入Apollo染色液避光室溫孵育30 min，棄染色液后加入0.5% Triton X-100清洗2～3次，加入無水甲醇清洗2次以此來降低染料背景，PBS清洗細胞2次后每孔加入100 μL 1×Hoechst 33342工作液室溫避光孵育30 min，PBS清洗細胞2次后倒置熒光顯微鏡觀察拍照。隨后通過Western blot檢測MSCs中PCNA的表達量。

4 統計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，所用正態分布統計數據采用均數±標準誤(mean±SEM)表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 Rab27a基因敲除小鼠的建立

本研究利用TALEN技術在小鼠Rab27a基因中第2個外顯子上敲除7個堿基。Rab27a在細胞內囊泡的運輸起著重要的作用，Rab27a基因敲除小鼠由于毛囊根部的黑色素小體釋放障礙而導致其毛發呈現灰白色,見圖 1A；隨后經過基因測序可以看到相對于野生型小鼠，Rab27a基因敲除小鼠存在7個堿基的缺失,見圖1B；同時Rab27a蛋白表達也明顯降低，見圖1C，說明利用TELEN技術成功構建Rab27a基因敲除小鼠。

2 小鼠骨髓間充質干細胞的鑒定

骨髓間充質干細胞表面表達特異性抗原Sca-1和CD44，而不表達造血干細胞表面特異性抗原CD34和CD45。流式細胞術結果顯示，第3代骨髓間充質干細胞表面標志物Sca-1表達率為95.60%±1.06%，CD44表達率為96.09%±1.79%，呈現強陽性；CD34表達率為0.54%±0.16%, CD45表達率為0.55%±0.17%，呈現陰性，見圖2。

3 外泌體釋放的數量及鑒定

利用結晶紫實驗來計數KO-MSCs和WT-MSCs的數量,見圖3A；同時利用外泌體提取試劑盒提取MSCs釋放的外泌體并用NTA計數外泌體的數量，見圖3B；以此來計算單個MSCs釋放的外泌體的數量，見圖3C；利用透射電鏡來觀察外泌體的形態及大小，見圖3D；同時也檢測外泌體標志性蛋白CD63的表達[8]，見圖3E。由上述數據可發現，相比于WT-MSCs，KO-MSCs釋放的外泌體明顯減少。

4 外泌體釋放缺陷引起MSCs增殖能力降低

EdU實驗顯示在熒光顯微鏡下增殖期的MSCs發紅色熒光，用Image-Pro Plus 6.0計算紅色熒光及綠色熒光的數量，并經過SPSS 19.0統計可知，KO- MSCs的增殖能力顯著低于WT-MSCs,見圖4A。同時用Western blot檢測各實驗組MSCs中PCNA的表達量，可發現相比于WT-MSCs，KO-MSCs中PCNA的表達明顯下調,見圖4B。

Figure 1.Establishment of Rab27a knockout (KO) mice. A: the representative wild-type (WT) and KO mice; B: validation of Rab27a depletion in BM-MSCs by DNA sequencing; C: the expression of Rab27a was significantly reduced in the BM-MSCs of the KO mice. Mean±SEM. n=3. *P<0.05 vs WT-MSCs.

Figure 2.Surface marker determination of bone marrow mesenchymal stem cells. Mean±SEM. n=3.

Figure 3.The quantity and identification of the exosomes. A: crystal violet staining of BM-MSCs (×200); B: the exosomes released from WT-MSCs and Rab27a KO-MSCs were quantified by NTA; C: the relative amount of exosomes released from a single MSCs; D: isolated exosomes were confirmed by transmission electron microscopy; E: the protein expression of CD63 was detected by Western blot. Mean±SEM. n=3. *P<0.05 vs WT-MSCs.

Figure 4.The proliferation ability of KO-MSCs and WT-MSCs. A: EdU assay of BM-MSCs; B: the protein expression of PCNA was determined by Western blot. Mean±SEM. n=3. *P<0.05 vs WT-MSCs.

5 外泌體釋放缺陷引起MSCs對缺氧的耐受能力降低

利用MTS實驗來檢測經H2O2處理的間充質干細胞的活力，發現KO-MSCs對缺氧的耐受能力明顯低于WT-MSCs,見圖5A；同時用TUNEL實驗也發現KO-MSCs對缺氧的耐受能力明顯降低，見圖5B。

討 論

間充質干細胞分泌的外泌體用于心肌梗死的治療在近來的研究中備受關注，間充質干細胞來源的外泌體因攜帶有其宿主細胞的生物學信息而在心肌梗死中發揮心肌保護作用，所以干細胞分泌的外泌體將作為以后治療心肌梗死的一種重要的工具[9]，然而移植的間充質干細胞趨化至心肌梗死部位的存活率限制了干細胞的治療效果，所以趨化至心肌梗死部位的間充質干細胞對缺氧的耐受能力及增殖能力尤為重要。當前研究卻很少關注外泌體的釋放對間充質干細胞本身發揮生物學效應的影響，本文就簡約地闡述抑制間充質干細胞釋放外泌體可導致間充質干細胞增殖能力及對缺氧的耐受能力降低。

Figure 5.Defects in exosome release resulted in reduction of hypoxia tolerance. A: compare with WT-MSCs, the viability of KO-MSCs was significantly decreased after H2O2 treatment; B: TUNEL staining was used to assess the level of apoptosis (blue: DAPI; green: TUNEL; ×40). Mean±SEM. n=3. *P<0.05 vs WT-MSCs.

細胞通過內吞作用在胞內形成多囊泡體，在外界刺激時，Rab27a引導多囊泡體靶向移動至胞膜脂質筏，并與多囊泡體的效應蛋白(突觸結合蛋白4家族蛋白)結合致使多囊泡體與細胞膜相互融合并向胞外分泌外泌體[10]。本文運用TELAN技術靶向敲除C57BL/6J小鼠Rab27a基因[11]，并且從Rab27a基因敲除小鼠的骨髓中提取間充質干細胞，用外泌體試劑盒提取間充質干細胞釋放的外泌體，同時用NTA檢測外泌體的數量，實驗數據顯示Rab27a敲除的間充質干細胞分泌外泌體的量明顯減少。隨后我們探索抑制外泌體的釋放是否對間充質干細胞生物學特性產生影響。通過EdU實驗來檢測間充質干細胞的增殖能力，我們實驗發現相對于WT-MSCs的增殖能力，KO-MSCs的增殖能力明顯降低。眾所周知，間充質干細胞具有增殖及分化潛能并在一定條件下可以分化成多種功能細胞，以此在治療心肌梗死方面提供更為廣闊的應用前景。抑制間充質干細胞外泌體的釋放而引起間充質干細胞的增殖能力降低最終導致MSCs到達心肌缺血部位后發揮心肌保護效應的能力明顯降低。隨后我們還發現抑制間充質干細胞外泌體的釋放導致其缺氧耐受能力明顯下降。有研究表明體外移植的間充質干細胞趨化至心肌梗死部位后在缺氧的環境下存活率低，同時受損的心肌細胞分泌的外泌體可促進MSCs的凋亡，以此限制MSCs治療療效。目前尚不清楚抑制MSCs分泌外泌體后是否對其本身的缺氧耐受能力產生影響。通過我們的實驗發現，KO-MSCs的缺氧耐受能力明顯低于WT-MSCs。外泌體在最早發現時認為是轉運細胞廢物的囊泡，在隨后的研究發現外泌體還可以攜帶宿主細胞的生物學信號[10]。近期有研究表明外泌體可以將受損的DNA轉運出細胞，但是當抑制外泌體的分泌而導致受損的DNA 在細胞內大量堆積可引起機體的內源免疫反應，并激活了活性氧依賴的DNA損傷，這樣導致細胞周期阻滯甚至引起細胞凋亡[12]；我們前期實驗發現細胞分泌的外泌體減少，可導致細胞之間的信息交流減少，最終影響細胞的增殖和自噬?？偟膩碚f，細胞釋放外泌體減少，導致細胞的內外環境紊亂，進而影響細胞的生理功能。

綜上所述，本研究采用TALEN技術，建立Rab27a敲除的細胞模型，從而抑制間充質干細胞外泌體的釋放，導致其增殖能力及缺氧耐受能力明顯降低。