條件性基因敲除動物及其在毒理學研究領域的應用進展*

胡 紅 李子南 鄭 珊 敬海明 馮 穎 尤育洲 李國君 寧鈞宇，2

(1.北京市疾病預防控制中心/北京市預防醫學研究中心，食物中毒診斷溯源技術北京市重點實驗室，北京 100013)(2. 首都醫科大學公共衛生學院，北京 100069)

毒理學是一門實驗科學，其主要研究手段是動物實驗，旨在將外源化學物對實驗動物的毒性反應結果外推至人，以期評價外源化學物對人的危害，為確定安全限值和采取防治措施提供科學依據。隨著基因工程技術的發展，大量基因修飾動物越來越多地應用到毒理學實驗中。與野生型動物相比，基因修飾動物中特定基因的表達強度改變或功能喪失，可以加速某些疾病的進程(如腫瘤)，縮短毒理學試驗周期，有助于降低毒理學評價的成本。此外，“有害結局路徑(Adverse outcome pathway)”概念的提出將毒理學研究深入到基因、分子層面，而基因修飾動物的出現為探討毒物對機體的損傷機制提供了便利。

基因修飾動物包括轉基因動物、基因敲除動物以及基因敲入動物，在基因敲除動物中，應用Cre-LoxP重組酶系統將基因敲除局限于特定組織、細胞或時間進程中，便可獲得條件性基因敲除(conditional knock-out, cKO)動物。相對于傳統的完全性基因敲除(conventional knockout)動物，條件性敲除能使基因在時間和空間上的靶位修飾更加明確、精準，效果更加可靠。因此，cKO能避免傳統基因敲除動物的不足而用于具有胚胎致死性目的基因的研究，并用于研究基因在特定的組織或細胞中的生理病理功能。隨著DNA同源重組與胚胎干細胞等分子生物學技術的發展，條件性基因敲除技術日趨成熟，cKO動物模型大量出現，同時也為科學研究提供了更加廣闊的平臺。

鑒于條件性基因敲除動物具有如此優越性，在本文中我們主要闡述其原理和發展現狀，以及在毒理學領域的應用現狀和今后可能的發展方向。

1 條件性基因敲除動物的原理和發展現狀

胚胎干細胞的分離培養是成功制作cKO動物的重要基礎。1981年，英國科學家Evans和Kaufman提取出了小鼠的胚胎干細胞[1]。在此基礎上，1994年Gu等利用Cre-Loxp系統對胚胎干細胞進行改造，完成了第一例條件性基因敲除的研究[2]。時至今日，條件性基因敲除動物制備技術已經發展成熟，其主要步驟可簡述如下(圖1)[3]：①打靶載體的設計和構建。②打靶載體導入同源的胚胎干細胞(embryonic stem cell, ES)，并篩選發生同源重組的陽性ES克隆。③ES顯微注射和嵌合胚胎制備，并與Cre工具鼠雜交。④F1代的繁殖和鑒定。

圖1 條件性基因敲除動物制備簡述

目前，條件性基因敲除小鼠技術日趨成熟，并廣泛應用于免疫學[4]、臨床醫學(心臟病、肝病、糖尿病)[5-8]以及毒理學(神經系統、生殖系統、呼吸系統[9-11])等領域，為這些領域提供了一個全新、強有力的研究手段。

與小鼠相比，大鼠在神經系統、代謝方式等方面與人類更為接近，且由于個體比較大使得其在生物醫學實驗中更容易進行手術等操作，所以在神經系統、代謝方式的研究上是更理想的動物模型[12]。雖然具備以上優勢，但一直未能找到建立大鼠胚胎干細胞株的方式[13]，直到2008年，Li等才第一次成功地從大鼠胚胎中提取出胚胎干細胞，這是除小鼠外第二種動物建立的胚胎干細胞株[14]。Abbott曾在報道中預言，在不久的未來大鼠將會代替小鼠重新成為實驗室里的重要研究對象[15]。隨后，在2010年Tong又首次培育出了腫瘤抑制基因p53基因敲除的大鼠[16]。這一系列的突破使科學家利用大鼠作為動物模型、研究人類疾病的愿望有了實現的可能。由于測序等分子生物學技術的巨大進步，以及大鼠胚胎干細胞分離培養及基因敲除技術的逐步成熟，如今，各種類型的條件性基因敲除大鼠也已廣泛應用于科研各領域[17]。目前實現條件性基因敲除的動物還有斑馬魚[18]、秀麗隱桿線蟲[19]。

2 條件性基因敲除動物在毒理學中的應用

2.1 外源化學物致癌作用研究

與傳統的致癌實驗相比，轉基因動物和基因敲除動物的誘癌實驗一般在3個月左右就可以完成，這些基因突變模型不僅縮短腫瘤的潛伏期，還可增加腫瘤發生率[20]，因此更加省時、省力、經濟。無疑，基因改造的動物模型在毒理學安全評價中有很高的應用價值，但是在推廣應用前還需要進行系統的標準化并逐步完善評價體系。目前條件性基因敲除動物主要應用于致癌機制研究，以明確基因在癌癥形成過程中的作用機制。

芳烴受體(aryl hydrocarbon receptor, AhR)主要功能是與外源性芳香烴結合并將其轉運進細胞核內，是介導多種環境污染物反應的配體轉錄因子，比如2,3,7,8-四氯代二苯-并-對二噁英(2,3,7,8-TCDD)、苯并a芘(Benzoapyrene, BaP)。2,3,7,8-四氯代二苯-并-對二噁英(2,3,7,8-TCDD)是迄今為止人類已知的毒性最強的污染物，國際癌癥研究中心已將其列為人類一級致癌物。為了深入探討AhR的生理作用和建立危險性評價的有效模型，Schmidt等利用同源重組建立了AhR的全基因敲除小鼠，發現AhR-/-小鼠出現了不同程度的肝損害，這說明AhR在維持肝的正常生長和發育中起著重要作用[21]。根據Boutros等的研究，AhR自身就影響肝臟392個基因的表達[22]。經過TCDD處理后，在野生型和AhR敲除小鼠中有471個AhR依賴而非TCDD依賴的轉錄水平變化基因[22]。Cornelis J. Elferink等在條件性敲除小鼠肝臟AhR中，發現一個新的特異性內源性AhR信號通路靶基因Stanniocalcin 2 (Stc2)[23]。因為哺乳動物的Stc2是一種對非折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)和凋亡具有保護作用的分泌性糖蛋白[24]，所以認為AhR調節的Stc2對肝細胞具有一定保護作用。并且Elferink等還發現TCDD能導致AhR與Cyp1a1啟動子結合而不能與Stc2結合[23]，進一步深化了TCDD的肝臟毒性機制研究。

動物實驗研究對于鑒別人類化學致癌物發揮重要作用，盡管目前建立了很多小鼠靶基因突變模型來針對性地分析特定組織的腫瘤生長情況，但是仍沒有用來確定化合物潛在致癌性的模型系統。今后仍需建立不同的癌變模型，用以研究致癌物對特定組織的致癌作用。

2.2 發育毒性研究

根據Wilson致畸學基本原理，孕體對致畸因素的易感性依賴于孕體的基因型及其孕體與致畸因素相互作用的方式。在對化合物生殖毒性評價中，通過條件性基因敲除，可對胚胎致死性基因(如：重組人金屬蛋白酶10、PTEN、brca1/2等)的表達進行時空特異性控制，以避免出現死胎，并對其它基因相關聯的發育毒性進行機制研究。

1960—1962年間沙利度胺作為抗妊娠反應藥物應用于臨床后，出現8 000例海豹畸形兒，表現為四肢短缺陷、無眼、顎裂、骨骼發育不全、十二指腸和肛門閉鎖等，利用cKO動物可更加清晰認識其發育毒性的機制。Bashur等通過Jab1的cKO小鼠和微團培養發現：Jab1是體內早期胚胎肢發育所必須的調節因子，它可能通過“共激活”Y染色體“男性性別決定區族蛋白9”(SRY (Sex determining region Y)-box 9，Sox9)和BMP信號來起作用[25]。Notch信號通路是高度保守的，它對許多組織器官的發育都起著關鍵作用。電離輻射所導致的骨損傷可能是由于Notch1-4四種受體介導的信號通路[26]。Nantie等利用早期胚胎條件性Notch2敲除發現，Notch2的缺失對早期胚胎垂體的增殖影響不大，但是對產后孕體的維持和增殖至關重要，并且發現Notch信號對胚胎期和出生后的Prop1表達是必須的[27]?？傮w來講，cKO動物在發育毒性領域的應用還比較少，經典動物仍是篩選發育毒性的主流，但相關cKO動物能揭示產生發育毒性的機制，并能最終減少實驗結果外推的不確定性，具有一定的應用前景。在發育毒性應用的基礎上，cKO動物也為化學致突變性的研究提供了有希望的動物模型。

2.3 毒理基因組學研究

毒理基因組學是研究生物體的整個基因組如何對環境有害因素發生反應的一門新興學科。它利用人類基因組的資料，幫助篩選和鑒別潛在的環境毒物，并在基因組水平上闡明毒作用發生的機制。肝細胞生長因子(Hepatocyte growth factor，HGF/c-Met)在肝再生中的肝細胞存活和組織重構中發揮重要作用。在對肝臟Met條件性基因敲除的小鼠進行慢性CCl4染毒后，c-Met cKO小鼠更加容易發生肝損害并發展成肝纖維化。采用芯片平臺對小鼠的各個時間點轉錄組(基因的RNA表達)進行檢測，這可在全基因組的范圍內篩選出顯著改變的基因。然后用免疫蛋白印跡技術(Western Blot，WB)驗證入選的與肝纖維化相關的關鍵分子的蛋白表達水平，總轉錄組分析揭示了c-Met(Met proto-oncogene，c-Met)在與肝纖維化關鍵信號通路中的廣泛影響：趨化和炎性信號分子(MCP-1, RANTES, CXCL10)的下調以及其它相關基因的變化如細胞骨架網絡的重構(Actb,Tuba1a,Tuba8)、細胞間交流和粘附(Adam8,Icam1,Itgb2)、細胞增殖(Ccng2,Csnk2a,Cdc6,cdk10)以及DNA損傷和應激反應(Rad9, Rad52, Ercc4, Gsta1 and 2, Jun)[28]。

毒理基因組學的近期目標是確定全基因組中對某種有害因素產生應答的基因(信號分子的基因)，用于有害結局路徑的毒理學和相關疾病的研究；遠期目標是建立全基因組與蛋白質組毒性反應知識庫，開辟數字毒理學。cKO動物的出現將極大豐富毒理學反應知識庫。

2.4 藥物的藥效及安全性評價

在抗腫瘤藥物的研究中，可利用cKO動物對抗腫瘤藥物進行危險性分析，評價藥物的安全性。人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)是人類突變率最頻繁的腫瘤抑制基因之一。而PTEN雙等位基因敲除的胚胎致死性阻礙了PTEN完全敲除在癌癥研究中的應用。在cKO的技術成熟條件下，Mirantes等條件性敲除上皮細胞內PTEN分子，小鼠能很快生成子宮內膜腺瘤、前列腺上皮內瘤樣病變、甲狀腺增生；他們再將依維莫司連續給予15 d，每天10 μg/g體質量施加于這些小鼠，發現子宮內膜增生和甲狀腺增生得到抑制[29]。前列腺上皮條件性敲除PTEN能導致前列腺上皮內瘤，Hafeez等利用此模型研究發現口服白花丹素0.2 mg/g或者0.5 mg/g能抑制前列腺癌的發展，并且在第15周和30周時均沒有毒性指征[30]。cKO動物模型的出現為PTEN缺失的腫瘤的抗腫瘤藥物研究提供了很好的疾病模型。cKO動物為基因治療提供了更具體的動物模型，并為新的基因靶點提供更可靠的證據。

這些以cKO動物實驗為基礎的劑量-反應關系模型不僅整合了分子/生化反應、細胞/組織反應，還提供了發育毒性測定的靶組織劑量的藥物動力學信息，并揭示其分子機制。

3 結語

現有研究報導在條件性基因敲除的小鼠中，重組酶誘導劑多西環素不僅刪除目的基因，還影響免疫系統，降低回腸中Il1b, Il10, Il18，Tnf, Cxcl1, Cxcl2的表達以及結腸中Il18的表達[31]，盡管這有可能使得研究結果的解釋復雜化，但條件性基因敲除技術日趨成熟，cKO動物模型也為科學研究提供了更加廣闊的平臺，目前cKO動物的制作與發展應用日新月異[32-34]。國際基因敲除小鼠協作體(International Knockout Mouse Consortium)的一項新技術——高通量打靶技術，將基因工程鼠的批量生產成為可能，每個月能產生數以百計的基因敲除胚胎干細胞[35]。在許多復雜疾病方面，如心血管和精神疾病，大鼠在建立疾病模型過程中操作更加簡單，因此要比小鼠更有優勢。隨著研究的深入，生物學者通過從整體水平到細胞、分子水平的機制研究之后得到了大量數據，并建立假說，這些假說急需回到動物整體水平加以驗證，條件性基因敲除動物的出現給該需求提供了實驗的條件。根據現有文獻資料，毒理學領域應用cKO動物作為研究對象還不多，但近兩年有增加趨勢。隨著描述性毒理工作的完善，機制性毒理學研究的深入，更多的條件性基因敲除的動物將會應用于毒理學研究領域中，這將給未來的系統化、整體化、綜合化的毒理學研究趨勢提供可能。