Nf-κb在遺傳性糖尿病長爪沙鼠多種組織中的表達狀況*

龔菁菁 李小紅 王存龍 李銀銀 陳振文 杜小燕

(首都醫科大學基礎醫學院，北京 100069)

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是嚴重威脅人類健康的重大疾病之一。在我國，隨著生活方式的改變及人口老齡化，DM的患病率不斷上升，成為繼心血管疾病和腫瘤之后的第三大嚴重危害人類健康的慢性終身疾病。我國成人糖尿病患病率平均為11.6%，患病人數已達到1.14億[1]。2型糖尿病是糖尿病的主要類型，約占糖尿病人的90%[2]。2型糖尿病是由遺傳因素和環境因素共同作用導致的復雜遺傳病，以葡萄糖耐量降低、胰島素抵抗為主要特征[3]。但2型糖尿病的發病機制仍不完全清楚，由于糖尿病是多基因控制的復雜疾病，易感基因的存在及其功能改變是影響糖尿病發生的重要因素。本課題組前期利用自行培育的近交系長爪沙鼠2型糖尿病模型材料，通過抑制消減雜交(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)的方法在高血糖和正常血糖長爪沙鼠骨骼肌中發現核轉錄因子κb(Nuclear factor κB，Nf-κb)差異表達。但其在自發性2型糖尿病長爪沙鼠不同組織中的表達水平如何還不得而知。因此，本文主要研究Nf-κb在糖尿病沙鼠和正常沙鼠的骨骼肌、肝臟、腎臟、脂肪、心臟和腦組織中mRNA和蛋白水平的表達情況，以期尋找長爪沙鼠糖尿病模型致病機制中Nf-κb的作用和靶器官，為研究長爪沙鼠2型糖尿病新模型的發生機制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取近交系糖尿病模型長爪沙鼠和正常對照組沙鼠各6只，12～15周齡，雌雄各半。所有長爪沙鼠均來自首都醫科大學實驗動物部，飼養于控制溫濕度的普通環境中(SYXK(京)2013-0005)。

1.2 樣品采集

動物過量麻醉安樂死后，解剖采集新鮮組織后立即置于液氮中。樣品包括患糖尿病和正常長爪沙鼠的骨骼肌、肝臟、腹部脂肪、腎臟、心臟、腦組織。

1.3 RNA提取及cDNA的制備

從液氮中取出凍存的長爪沙鼠6種組織，分別加入約1 mL TRIzol Reagent(Invitrogen，USA)，用均質器將組織打碎，于室溫放置1 min，然后加入約200 μL的三氯甲烷，混勻后4 ℃放置15 min，4℃14 000 r/min 離心15 min，轉移上層水相至新離心管，加入約500 μL異丙醇，混勻后4 ℃靜置10 min，4℃ 14 000 r /min 離心15 min，棄上清。加入70%乙醇顛倒洗滌沉淀，4℃ 12 000 r/min 離心10 min，棄上清。重復以上步驟1次，以充分洗去沉淀所含鹽分。室溫自然干燥，加入適量的RNA-Free水溶解得到總RNA。脂肪組織的總RNA提取用脂肪RNA提取試劑盒進行(Qiagen, USA)。采用Nanodrop 2000c(Thermo scientific, USA)分析RNA濃度和純度。按照快速反轉錄試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)對上述總RNA樣品進行逆轉錄，得到相應的cDNA。

1.4 Q-PCR

按照SSH得到的Nf-κb基因片段序列，利用 Primer Premier 5.0 設計PCR擴增引物多對。除肌肉選取Gapdh基因作為內參外，其他組織均選取β-actin基因作為內參基因并設計引物。引物序列如表1所示，均由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。

表1 Nf-κb和內參基因Q-PCR引物序列

采用Real-time PCR法在Bio-Rad CFX96 manager System上對Nf-κb的mRNA水平進行檢測。所用試劑為實時定量PCR試劑盒(天根)，反應體系為20μL。反應條件如下: Q-PCR Master Mix 10μL，上游引物0.6μL，下游引物0.6μL，模板cDNA 1μL，ddH2O 7.8μL。反應程序均為: 95℃ 15min，之后95℃ 10s，58℃ 35s，共擴增40個循環，每個循環結束時檢測熒光; 熔解曲線分析從60℃到95℃，每0.5 ℃檢測一次。

1.5 Western blotting

取液氮凍存的長爪沙鼠骨骼肌、肝臟、腎臟、脂肪、心臟和腦組織，剪碎后用組織蛋白提取試劑盒(康為世紀)提取總蛋白，用BCA定量法對蛋白進行定量。取30μg總蛋白進行SDS-AGE凝膠電泳分離，電轉蛋白至NC膜。以TBS(25 mmol/L Tris, 0.15 mol/L NaCl, pH7.2)含5%脫脂牛奶和0.05% Tween-20 封閉過夜。用Nf-κb抗體(1∶1 000稀釋，CST，USA)4 ℃孵育過夜，TBST洗滌后與二抗(辣根過氧化酶聯的抗兔血清)室溫孵育1 h，TBST洗膜后用化學發光法顯色。骨骼肌、肝臟、腎臟、心臟和腦組織選用Gapdh做內參基因，脂肪組織選用β-actin作為內參基因。最后用凝膠圖像分析系統(Bio-Rad)掃描蛋白質印跡條帶灰度。

1.6 統計方法

所有數據均采用SPSS 16.0軟件進行統計分析。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗方法分析。以P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Nf-κb基因在糖尿病沙鼠和對照組的6種組織中mRNA表達的差異

采用實時定量熒光PCR法分別檢測了糖尿病沙鼠和正常沙鼠的骨骼肌、肝臟、脂肪、腎臟、心臟和腦組織Nf-κb的mRNA表達水平。結果發現，與對照組相比，在骨骼肌中Nf-κb在糖尿病組有高表達趨勢(圖1)。參考SSH的結果，該基因在糖尿病沙鼠中的表達量高于正常沙鼠，所以該結果與SSH結果相吻合。在脂肪、肝臟和心臟組織中，Nf-κb在糖尿病組的表達量均低于對照組，而脂肪組織mRNA表達量的降低有顯著性差異。在腎臟和腦組織中，Nf-κb在糖尿病組有高表達的趨勢。

圖1 Nf-κb在糖尿病和對照組長爪沙鼠6種組織中的mRNA表達水平

2.2 NF-κB在糖尿病沙鼠6種組織中蛋白的表達水平

Western Blotting檢測NF-κB蛋白在6種組織中的表達結果顯示，骨骼肌中糖尿病組的蛋白水平高于對照組，與Real-timePCR的趨勢一致(圖2)。脂肪和心臟組織中NF-κB在糖尿病組中蛋白水平略低于對照組，與其mRNA的表達趨勢相一致。而肝臟、腎臟和腦組織中，糖尿病組與對照組相比NF-κB蛋白是略微增加的，腎臟和腦組織的NF-κB在mRNA和蛋白水平表達趨勢相吻合。

圖2 NF-κB在糖尿病沙鼠6種組織中蛋白的表達情況

3 討論

在糖尿病人群中，2型糖尿病人占比最高[4]，因此，對其機制的研究一直是糖尿病研究的熱點。2型糖尿病作為多基因控制的復雜疾病，尋找和確定易感基因尤為重要，目前對T2DM的病因和關鍵基因的篩選還遠遠不夠，通過糖尿病動物模型篩選易感基因已成為研究2型糖尿病發病機制的重要的手段。近年來，越來越多自發性糖尿病動物模型的出現能模擬各種人類糖尿病的癥狀，成為研究糖尿病遺傳相關分子機制的關鍵載體[5]。本課題組前期經過定向培育逐步形成了一個長爪沙鼠自發性糖尿病模型群體，其生化指標和病理組織形態均符合糖尿病標準，且這些性狀具有遺傳性，是研究2型糖尿病的病生理特點以及致病機制理想的動物模型和實驗材料。為了更深入探索該模型發生的分子機制，我們又通過SSH方法從骨骼肌中篩選出糖尿病和正常沙鼠差異表達的基因并進行序列比對和分類。本研究挑選出了其中可能與糖尿病和代謝相關的候選基因核轉錄因子κb(Nuclear factorκB，Nf-κb)進行了不同組織器官的表達水平分析。

由于2型糖尿病是一類重要的代謝性疾病，外周組織和核心器官的代謝和功能都可能受到影響，本研究選取了骨骼肌、肝臟、脂肪、腎臟、心臟和腦組織進行分析，因為這些組織器官均是重要的糖代謝器官或糖尿病受累器官。Nf-κb是一個重要的炎癥因子，而炎癥狀態與胰島素抵抗、肥胖、2型糖尿病等代謝綜合征的發展相關[6]。早在1986年，Sen和Baltimore[7]首次發現，在B細胞核提取物中有一種能與免疫球蛋白κ的輕鏈編碼基因增強子κB序列(GGGACTITCC)特異結合的核蛋白因子，稱之為Nf-κb。實際上，各種致癌物質、生長因子、微生物群和促氧化劑造成的炎癥刺激都可以激活Nf-κb，其在炎癥中起著核心作用，同時也在很多癌癥中表達[8]。Nf-κb通過調節靶基因表達，從而參與炎癥、免疫反應、細胞凋亡和腫瘤等相關的病理過程，且在2型糖尿病致病機制中發揮著重要的作用。本試驗對高血糖長爪沙鼠和正常長爪沙鼠幾種重要組織器官中Nf-κb的表達水平的研究結果表明，雖然在肝臟等器官中其表達水平有變化趨勢，但沒有統計學差異。只有在脂肪組織中的表達是降低的，據文獻報道，肥胖能激活Nf-κb從而增加2型糖尿病的風險[8-9]，肥胖癥或肝臟脂肪變性的小鼠體內低水平的IKK-β會增加Nf-κb的活性，從而促進2型糖尿病的發展[10]。食源性肥胖小鼠的肝細胞中Nf-κb是高表達的，而抑制Nf-κb可以改善肝臟胰島素敏感性，并且抑制了cAMP/PKA通路。我們的實驗結果顯示，在糖尿病長爪沙鼠中，無論是肝臟還是脂肪中的Nf-κb都是低水平表達的，這可能是和我們挑選的動物不是肥胖型糖尿病有關，也間接說明肥胖對Nf-κb的刺激在肥胖引起的糖尿病高風險中發揮更重要的作用。

總之，在長爪沙鼠糖尿病模型中，我們發現Nf-κb在脂肪中的表達水平降低，可能與糖尿病的發生發展有關，這為研究長爪沙鼠2型糖尿病的發生機制提供了一個新的思路。