重樓皂苷的抗腫瘤作用機制研究進展

錢芳芳 ，闕祖俊 ，田建輝2，#

1上海中醫藥大學龍華臨床醫學院，上海200030

2上海中醫藥大學附屬龍華醫院腫瘤科，上海200032

3上海市中醫藥研究院中醫腫瘤研究所，上海200032

隨著社會經濟的發展和人們生活節奏的加快，中國惡性腫瘤的發病率逐年上升，據最新數據顯示，2014年中國新發惡性腫瘤病例約380.4萬例，病死病例229.6萬例，腫瘤發病率為278.07/10萬，腫瘤病死率達到167.89/10萬[1]。針對腫瘤患者的治療，除常見的治療方式如手術、放療和化療等，中醫中藥也發揮著重要的作用，積極挖掘中醫藥在惡性腫瘤治療中的作用，具有重要的臨床價值。七葉一枝花為臨床常用的一味中藥，其主要抗腫瘤成分為重樓皂苷，本文對近年來重樓皂苷在抗腫瘤作用機制方面的研究進展進行綜述。

1 重樓皂苷的抗腫瘤作用

重樓為百合科植物云南重樓或七葉一枝花的干燥根莖[2]。重樓又名蚤休，在《神農本草經》中有記載，性微寒，味苦，歸肝經，有小毒?？捎糜陴郫彴b腫、咽喉腫痛、蛇蟲咬傷、跌撲傷痛、驚風抽搐的治療。重樓作為清熱解毒類中藥在臨床腫瘤治療工作中被廣泛應用，在抑癌方面也收到了良好的效果[3-4]。同時，基礎研究也發現，七葉一枝花能夠明顯抑制肝癌H22荷瘤小鼠實體瘤的生長，并延長H22荷瘤小鼠的生存時間[5]；重樓皂苷I可以抑制人卵巢癌HO-8910PM細胞在裸鼠體內皮下瘤和肺內轉移瘤的生長[6]；重樓醇提物及重樓皂苷單體對非小細胞肺癌細胞株、神經膠質瘤細胞株、人卵巢癌細胞株、胃癌細胞株、乳腺癌細胞株均有明顯的抑制作用[7-11]。目前，甾體皂苷被認為是重樓提取物中的主要活性物質[12]，在抗腫瘤作用中發揮著重要的作用，其主要通過阻滯腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、抗血管生成、誘導腫瘤細胞分化、抑制腫瘤細胞轉移、逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥性等方面發揮抗腫瘤作用[13-14]。

2 阻滯腫瘤細胞增殖

細胞的有絲分裂分為2個階段：間期和有絲分裂期（S期），其中間期包括DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（M期）、DNA合成后期（G2期）。生理情況下，各時期依次交替，細胞增殖調節蛋白（包括細胞周期蛋白、細胞周期蛋白依賴性激酶）、原癌基因、抑癌基因、有絲分裂檢查點蛋白都對這一環節的調控有著至關重要的作用，任何一個環節無法順利完成都會影響細胞的增殖[15]。暫不分裂的細胞則進入G0期。不同器官來源的腫瘤細胞經重樓皂苷干預后，會被阻滯在不同時期，這提示重樓皂苷可能通過不同的作用機制影響腫瘤細胞的增殖。

王青等[16]研究發現，重樓皂苷I可顯著抑制循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）增殖，且呈現出濃度依賴性，并將CTC周期阻滯在G0/G1期，表明重樓皂苷I可能通過抑制DNA合成從而發揮抗腫瘤作用。于思等[17]研究發現重樓皂苷I可抑制HCT116細胞內微管結構，進而影響到紡錘體的形成，從而將HCT116細胞周期阻滯于G2/M期。Cai等[18]研究發現，重樓皂苷G可誘導口腔癌細胞系OECM-1細胞周期停滯在G2/M期；進一步研究發現，重樓皂苷G通過調控DNA損傷修復途徑關鍵激酶毛細血管擴張共濟失調突變（ataxia-telangiectasia mutated，ATM）蛋白激酶，進而刺激ATM下游的檢測點激酶1/2（checkpoint kinase 1/2，Chk 1/2），使細胞分裂周期蛋白25同源蛋白C（cell division cyclin 25 homolog C，cdc25C）抑制性磷酸化水平增加，最終導致周期素B1和細胞分裂周期蛋白2復合物失活，從而使細胞周期停滯在G2/M期。

3 誘導腫瘤細胞凋亡

細胞程序性死亡又稱凋亡，是指在基因調控下細胞進行的一系列有序的自毀過程。經典的凋亡途徑包括死亡受體介導的外源性途徑和線粒體介導的內源性途徑，因此可通過對死亡受體、線粒體、凋亡抑制蛋白和天冬氨酸半胱氨酸特異性蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）等多個環節的調控誘導細胞凋亡，也可通過調節相關信號通路的轉導達到誘導凋亡的目的[19]。誘導腫瘤細胞發生凋亡是治療腫瘤的一條重要途徑。

3.1 影響線粒體途徑促進凋亡

細胞在受到外界有害物質刺激時，細胞內產生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS），破壞了細胞內原本的抗氧化保護機制之間的平衡，引起細胞組織的損傷，線粒體膜表面去極化，膜電位發生改變，引起細胞色素C的釋放，這一過程在細胞凋亡中起著至關重要的作用。

程卉等[20]通過觀察不同濃度的重樓皂苷Ⅱ對黑色素瘤B16增殖的影響，發現重樓皂苷Ⅱ可顯著抑制B16細胞的增殖，且具有時間和濃度依賴性；同時研究還發現，隨著藥物濃度的增高，細胞內ROS的含量顯著提高，線粒體膜電位水平隨著藥物濃度的升高而降低，由此表明，重樓皂苷Ⅱ可能通過線粒體氧化應激通路從而誘導B16細胞凋亡。陳舒怡等[21]通過熒光顯微鏡觀察到重樓皂苷I作用于人肺癌NCI-H661細胞后，隨著藥物作用時間延長，細胞內線粒體的熒光強度逐漸減弱至消失；研究者還更加直觀地觀察到重樓皂苷I作用2 min后，大鼠腦皮質海馬神經元線粒體發生碎裂，表明重樓皂苷I可通過促進線粒體碎裂誘導細胞凋亡。Zhang等[22]研究發現，重樓皂苷Ⅶ可誘導肝癌HepG2細胞凋亡，其作用機制可能為ROS通路介導的線粒體途徑的激活和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）、抑癌基因PTEN、p53通路誘導的細胞凋亡。

3.2 影響凋亡信號轉導（蛋白表達）

在凋亡的過程中，caspase家族在凋亡信號的傳遞過程中起著重要的作用，細胞色素C釋放后與凋亡相關因子結合形成多聚體，再與caspase 9結合形成凋亡小體，活化的caspase 9激活下游的蛋白如caspase 3，啟動凋亡。王青等[23]檢測了重樓總皂苷作用于A549細胞后凋亡率和凋亡相關蛋白的變化，研究結果表明重樓總皂苷可顯著誘導A549細胞凋亡，并上調促凋亡蛋白caspase 3的表達，下調抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤因子-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的表達。蔡虹和楊春輝[24]研究重樓皂苷D對慢性粒細胞白血病細胞株K562的作用，結果表明重樓皂苷D通過上調細胞色素C、caspase 3和Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2-associated X，BAX）的表達，以及下調Bcl-2的表達，誘導K562細胞的凋亡。Watanabe等[25]研究發現重樓皂苷D通過上調caspase 3/7/8的表達誘導神經母細胞瘤NB-69細胞株發生凋亡。

3.3 調控細胞因子

腫瘤細胞并非孤立存在，而是與周圍組織結構一起存在于機體。腫瘤細胞以及周圍存在的基質細胞、細胞因子、趨化因子等一起組成了腫瘤微環境。腫瘤微環境在調控腫瘤細胞發生免疫逃逸、進展和轉移的過程中非常關鍵[26]。腫瘤微環境中各組成成分的變化影響著腫瘤細胞的生物學行為。滕文靜等[27]研究發現重樓皂苷可能通過下調白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的分泌，抑制JAK/STAT3信號通路的表達進而誘導結直腸癌SW480細胞凋亡。鄧碧凡等[28]通過實驗研究觀察到重樓皂苷I能夠降低低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達，影響腫瘤微環境中含氧量和腫瘤血管生成，從而抑制喉癌Hep-2細胞的增殖。

4 抗血管生成

腫瘤細胞具有無限增殖的能力，這一過程需要豐富的血管為其輸送營養成分，持續的血管生成被列為腫瘤的十大特征之一[29]。因此，抑制腫瘤血管生成可以切斷腫瘤細胞的養分供給，從而達到抗腫瘤的作用。王娓娓等[30]通過研究發現重樓皂苷I可以抑制冠狀動脈內皮細胞生長，降低細胞活力、鈣黏蛋白mRNA的表達，增加caspase 3mRNA的表達。畢葳等[31]通過提取重樓皂苷I、重樓皂苷Ⅱ、纖細薯蕷皂苷，觀察其干預雞胚絨毛尿囊膜后對血管生長的影響，實驗結果顯示干預組相比空白組小血管數目明顯減少，其中重樓皂苷I組與空白組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），說明重樓皂苷I有抑制血管生成的作用。Wnt5A屬于Wnt蛋白家族的成員之一，其在組織中的表達與血管新生密切相關。Gu等[6]研究重樓皂苷I對人卵巢癌HO-8910PM細胞株接種的裸鼠皮下瘤和肺轉移瘤的影響，發現重樓皂苷I可能是通過調控caspase 9、C-jun和Wnt5A的表達，從而對腫瘤有明顯的抑制作用。

5 誘導腫瘤細胞分化，抑制腫瘤細胞轉移

近年來，針對腫瘤的治療策略逐漸從“治瘤”向“治人”的方向轉變，“人瘤并存”[32]的思想也越來越得到學術界和臨床醫師的認可。腫瘤細胞與正常細胞相比，失去了正常的分化能力，因此可通過誘導腫瘤細胞分化來“改造”腫瘤細胞。有研究表明，重樓皂苷D能夠顯著上調慢性粒細胞白血病K562細胞表面分化抗原CD14的表達，誘導細胞向單核-巨噬細胞分化[24]。

腫瘤患者的治療原則始終貫徹的是防治復發和轉移，腫瘤患者一旦出現復發或轉移，將對患者的生活質量和治療信心產生巨大的影響。因此，防治復發和轉移是術后患者治療的首要目的。牟海軍等[33]通過研究重樓皂苷聯合順鉑對人肺腺癌A549細胞凋亡及轉移的影響，探討重樓皂苷聯合順鉑抗肺癌的增效機制，發現重樓皂苷聯合順鉑在誘導肺腺癌A549細胞凋亡和減少腫瘤細胞轉移方面具有協同增效作用。Gu等[34]研究發現重樓皂苷I可以下調人卵巢癌HO-8910PM細胞PIK3C2B和Wnt5A的表達，從而抑制HO-8910PM細胞的增殖和轉移。

6 逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥性

在臨床治療中，晚期腫瘤患者大多數都會經過化療、放療、靶向治療等多學科綜合治療，腫瘤細胞在這一過程中容易產生耐藥性，使治療不能達到理想的效果，或者容易產生復發和轉移。因此，增強藥物對耐藥細胞株的損傷作用，可能為開發新藥提供思路。龐曉輝等[35]利用大劑量沖擊法成功誘導奧沙利鉑耐藥結腸癌細胞株SW480/L-OHP和LoVo/L-OHP，并觀察到重樓皂苷I能夠通過上調BAX、caspase 3蛋白表達，誘導結腸癌及其耐藥株發生凋亡。Wang等[36]研究發現重樓皂苷Ⅶ可以通過調控P21信號通路和誘導G1期細胞阻滯增強獲得性耐吉非替尼H1975細胞株對吉非替尼的敏感性，從而為克服獲得性表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制藥（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）耐藥非小細胞肺癌提供了新思路。

7 小結

近年來，中醫藥在腫瘤治療中的優勢得以凸顯，中西醫在惡性腫瘤的治療理念、療效評價等方面逐漸趨同，中西醫結合治療成為趨勢[37]。中藥及其提取物因多靶點抗腫瘤作用機制在臨床實踐中得到廣泛應用。重樓作為臨床常用的抗腫瘤藥物，其主要活性物質重樓皂苷的抗腫瘤作用在基礎研究領域也得到證實。不斷探索重樓皂苷抗腫瘤的具體作用機制，發掘重樓皂苷類及其他中藥單體的抗腫瘤作用，為提高臨床療效找到更多更有效的路徑。未來對于中藥及其單體的研究可在以下方面進行深入探討：①給藥方式的改變。隨著藥物提取方法的改進和現代生物醫學工程技術的發展，單體濃度和純度更有保障，給藥方式也有創新。例如可借鑒納米技術完成重樓皂苷的給藥，以期提高藥物到達靶細胞的效率，提高針對靶細胞的“特異性”治療作用，從而提高臨床療效[38]。②不同單體的聯合用藥，研究中西醫藥物的協同增效作用及其機制。中藥方劑遵從“配伍”的原則，力求使臨床療效達到最優。不同藥物可通過不同的機制發揮抗腫瘤作用，聯合用藥則與中藥配伍殊途同歸，例如中藥單體聯合[39]、中藥及其單體與化療藥物、分子靶向藥物的結合[40]，可共同作用于腫瘤細胞，提高療效，降低不良反應對患者生存質量的影響。③優化研究平臺。目前針對腫瘤細胞的基礎研究多采用二維培養體系，體內多采用皮下移植瘤模型等。事實上，這種培養模式與腫瘤發病的臨床實際有一定差距。符合腫瘤臨床實際的發病模型可更客觀地評估藥物的實際藥理作用和機制。例如肺癌原位移植瘤[41]、研究腫瘤轉移專用的CTC體外研究體系[42]、三維體外細胞模型的應用[43]等，技術的革新與發展，必將加快新藥研發的速度，為攻克臨床治療腫瘤的難題提供新的機遇和思路。