結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤基因異常與轉化醫學的研究進展△

齊菲，董梅

國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫學研究中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院內科，北京100021

結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤（extranodal natural killer/T-cell lymphoma，nasal type，NKTCL）是成熟（外周）T細胞或自然殺傷（natural killer，NK）細胞淋巴瘤的一個重要病理亞型，主要起源于NK細胞，少數起源于細胞毒性T細胞[1]。NKTCL發病具有明顯的地域差異，西方國家少見，但卻是亞洲最常見的成熟T細胞或NK細胞淋巴瘤（22.4%）[2]。NKTCL常見于上消化呼吸道等結外部位，尤其是鼻腔和韋氏環；上消化呼吸道以外常見原發部位為消化道、皮膚、皮下組織、睪丸等[3]。其組織學上表現為伴隨腫瘤細胞浸潤的、血管中心性壞死性病變。免疫組化可見CD3ε（細胞質）、CD56、細胞毒標志物（顆粒酶B、穿孔素、TIA-1）陽性，sCD3（細胞膜）、CD5陰性，但是無T細胞抗原受體（T cell receptor，TCR）基因重排（起源于 NK細胞者）。原位免疫雜交（in situ hybridization，ISH）可見NKTCL腫瘤細胞EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）編碼RNA陽性，提示EBV感染在NKTCL發病中可能具有重要意義，但其病因學及分子病理機制尚未完全明確[4]。

NKTCL總體上表現為惡性進展性疾病。近年來，隨著放療技術的進步、化療方案的優化以及造血干細胞移植技術的進步，早期NKTCL患者的生存情況明顯改善，5年總生存率（overall survival，OS）可達64%～88%[5]。然而，NKTCL是一種異質性疾病，預后不一，即使接受放化療聯合治療，仍有10%～30%的早期患者出現治療失?。ň植繌桶l或遠隔部位轉移）[6]；此外，約20%的患者初治時即為晚期。治療失敗或晚期NKTCL患者的疾病進展迅速，預后差，5年OS僅為0～20%[7]。

目前認為，年齡、分期、B癥狀、美國東部腫瘤協作組（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）評分、局部淋巴結受侵等因素與NKTCL預后相關。NKTCL預后評價系統包括美國國家綜合癌癥網絡（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南推薦的預后評分和Nomogram預后模型[8-9]。NCCN指南推薦的預后評價系統包括年齡＞60歲、Ⅲ/Ⅳ期、非鼻腔病變、遠處淋巴結受侵和EBV-DNA載量[8]。Nomogram模型包含年齡、ECOG評分、分期、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平、局部淋巴結受累（Ⅱ期）及腫瘤外侵5個危險因素，可以準確預測5年生存率，同時對臨床治療模式的選擇具有重要指導意義[9]。上述預后評分系統具有良好的臨床應用價值，但均由臨床因素構成，因此可能具有一定的局限性。

目前淋巴瘤基因水平的研究及成果主要集中在B細胞淋巴瘤。研究證實，濾泡性淋巴瘤中存在7個常見基因突變，并對預后有不同程度影響；將異?；蚺c臨床因素[濾泡性淋巴瘤國際預后指數（follicular lymphoma international prognostic index，FLIPI）+ECOG評分）]相結合而建立的m7-FLIPI模型已被NCCN指南推薦用于濾泡性淋巴瘤患者預后風險分層[10]。隨著基因檢測技術的進步及應用的推廣，NKTCL相關基因改變的研究也方興未艾。結合目前研究進展推測，NKTCL中可能存在某些特定基因改變參與疾病的發生、進展及預后，對特定基因改變的認識可能有助于精準治療及預后評價。本文對目前NKTCL相關的基因異常作簡要綜述，歸納常見的基因改變及潛在靶向治療進展，初步探討基因異常在轉化醫學中的意義。

1 概述

1.1 NKTCL常用基因檢測方法

目前，國內外針對NKTCL基因水平的研究均以福爾馬林固定、石蠟包埋的腫瘤組織切片和（或）細胞系為檢測標本，主要采用微陣列比較基因組雜交（array comparative genomic hybridization，Array-CGH）技術和DNA測序（gene sequencing）技術進行檢測。Array-CGH可以快速全面地分析某個特定染色體、基因組的一段區域或全基因組的DNA拷貝數的變化。DNA測序技術，尤其是二代DNA測序（next-generation sequencing，NGS）技術，包括全基因組、全外顯子、目標區域（靶基因）測序，檢測通量大、耗時短、精確度高，被越來越多地應用于NKTCL研究領域。此外，基因表達譜（gene expression profiling，GEP）、ISH、免疫組化、微小RNA（microRNA，miRNA）檢測等技術也被用于基因轉錄后水平的檢測。RNA干擾技術可在轉錄后水平沉默目標基因，反方向驗證特定基因的功能。上述不同水平的技術結合研究將有助于異?；虻拇_定、基因功能的分析。

1.2 NKTCL基因研究現狀

對NKTCL基因異常的研究主要集中于亞洲國家，尤其是中國、日本、韓國及新加坡，此外法國、西班牙、美國等國家及地區也有相關研究。由于NKTCL的發病率低、腫瘤組織壞死嚴重、取材困難等原因，已有研究絕大部分為小樣本探索性研究。

已發表的研究結果顯示，與其他淋巴造血系統腫瘤類似，在NKTCL中也常伴隨許多基因改變，但目前尚未發現特定的染色體易位[11-13]?；贜KTCL高異質性，且各研究中診斷標準、取材方法及部位、基因檢測方法、檢驗試劑等的差異，目前尚無明確統一的基因異常結果。NKTCL異?；蚋淖儚碗s多樣，涉及細胞因子、細胞基質、生長因子及受體、癌基因與抑癌基因等，參與細胞周期調控、細胞凋亡、表觀遺傳學以及多種信號通路等[11]。目前最大樣本量NKTCL基因異常的研究來自中國，Jiang等[14]應用全基因組測序方法確定了25例NKTCL患者腫瘤組織常見的體細胞突變，隨后采用靶基因測序在80例NKTCL患者中進行了驗證。研究發現，RNA解旋基因DDX3X是最常見的基因突變（20%），其次是抑癌基因TP53、MGA、JAK-STAT通路的STAT3和STAT5B，以及表觀遺傳調控基因MLL2、ARID1A、EP300和ASXL3等。Array-CGH研究顯示，NKTCL患者存在多種染色體異常，如 1q23.1-q24.2、1q31.3-q44獲得，7p15.1-p22.3、17p13.11 缺失[12]。此外 4q、6q、7q、11q、12q和15q缺失，2q、10q和13q獲得也是常見的染色體異常改變[13]。其中，6q21-q25缺失可能是最常見的染色體異常，涉及PRDM1、BLIMP1及FOXO3等多項靶基因改變[15]。

針對特定靶點或通路的藥物研究為NKTCL患者的治療提供了新的思路。zeste基因增強子的人類同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）抑制劑（ZLD10A）、雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，MTOR）抑制劑（雷帕霉素）及Janus激酶3（Janus kinase 3，JAK3）抑制劑（tofacitinib）等對NKTCL的抑制作用已得到體內外試驗的證實[16-19]。

2 NKTCL相關的基因突變

2.1 EBV相關基因

EBV屬于皰疹病毒家族成員，主要攻擊B淋巴細胞，也可感染NK或T細胞[20]。幾乎100%的NKTCL可見EBV感染。目前普遍認為EBV是NKTCL重要的致病因素[21]。治療前后外周血EBV-DNA滴度、EBV-EA-IgA及VCA-IgA水平可能是NKTCL療效、復發風險及預后的重要預測因子[22-25]。

EBV病毒感染后，其基因組可嵌入宿主細胞中，誘導細胞產生各種抗原，包括EBV編碼核抗原（EBV-determined nuclear antigen，EBNA）、潛伏膜蛋白（latent membrane protein，LMP）1、LMP2A、LMP2B以及EBV編碼RNA（EBV-encoded RNA，EBER）等[26]。其中，LMP1蛋白被認為是EBV相關蛋白中最重要的癌蛋白。LMP1蛋白破壞細胞信號轉導通路，導致靶細胞的增殖和細胞程序性死亡的同步破壞，活化核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）、干擾素調節因子7（interferon regulatory factor 7，IRF7）和Janus激酶/信號轉導及轉錄激活因子（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT）通路，促進細胞轉化和永生[26-28]。LMP2A主要參與細胞周期及凋亡通路等細胞通路的調節，促進腫瘤形成和抗腫瘤細胞凋亡。Mao等[26]分析了16例NKTCL組織標本的免疫組化結果，發現在腫瘤細胞中可見LMP1和LMP2A高表達（56.25%和 43.75%），LMP1或LMP2A高表達患者的總體預后與LMP1或LMP2A低表達者比較，差異均有統計學意義（P=0.049、0.036）。Sun等[29]的研究評估了LMP1基因在NKTCL中的作用，證實LMP1基因通過誘導survivin表達，抑制NF-κB和PDK/AKT通路，實現抑制腫瘤細胞凋亡的作用。該研究顯示，人EBV陽性的細胞系SNK-6和 SNT-8轉染LMP1（pcDNA3.1-LMP-1）基因后，細胞凋亡率分別增加了10.31%和12.05%；而敲除LMP1基因（轉染LMP1siRNA）后，SNK-6和SNT-8細胞的凋亡率分別減少了41.48%和35.63%；分別用survivin、PI3K/AKT、NF-κB抑制物處理細胞后，survivin表達下降，細胞凋亡率有所減少。

目前，EBV感染及EBV感染相關腫瘤的治療主要包括抗病毒、基因及相關治療、主動及被動免疫治療等?；蚣跋嚓P治療包括針對CCR4、PI3K/AKT/MTOR、NF-κB等EBV致病通路的抑制劑，目前多處于臨床前試驗階段。EBV腫瘤病毒疫苗（主動免疫）和過繼性免疫治療的研究取得較大進展，某些正在進行I/Ⅱ期臨床試驗[29-33]。針對EBV相關抗原的疫苗如EBNA-1（US20060188520、US7442377B2）、EBNA-2（US20060257356A1、7422751）、LMP1（US20070048329）等，可用于EBV感染及相關腫瘤的預防及治療[31]。韓國的一項臨床研究證實，針對LMP1/2A的過繼性免疫治療可能是NKTCL治療的一種安全且有效手段[32]。該研究共納入經誘導治療后緩解±后續放療的NKTCL患者10例，患者接受經LMP1/2A誘導產生的抗原特異性細胞毒T細胞（LMP1/2A CTL）回輸，中位隨訪55.5個月后，4年總生存率及無復發生存率分別為100%和90%。對EBV感染致病以及機體獲得保護性免疫的機制的準確認識可能是目前免疫治療面臨的主要問題。

2.2 EZH2基因

組蛋白修飾是表觀遺傳調控的主要機制之一，在腫瘤的發生中起重要作用[34]。多梳抑制性復合物 2（polycomb repressive complex 2，PRC2）是一個作用于組蛋白H3賴氨酸位點K27（H3K27）的高度保守的組蛋白甲基轉移酶，其中EZH2是PRC2的催化亞基[35]。PRC2參與H3K27的甲基化，通過改變染色體結構，使組蛋白和DNA的結合更加密實，影響相應基因的轉錄表達[36]。生理情況下，PRC2參與胚胎的正常發育以及T、B淋巴細胞的分化。10%的非霍奇金淋巴瘤可見SET結構域Tyr641和Ala677 突變[18，37]。EZH2突 變通常引起 NKTCL 患者組蛋白異常甲基化、PRC2靶基因沉默（包括BLIMP1、IRF4、PRDM1等）[36]。目前臨床前試驗已證 實 PRC2/EZH2抑 制 劑（DZNep、EPZ005687、GSK343、UNC1999、ZLD10A等）對EZH2突變相關T/B淋巴瘤細胞系的抑制作用，I期臨床試驗（GSK126）、I/Ⅱ期臨床試驗（EPZ-6438）正在進行中[18，38-42]。

在NKTCL中，EZH2的過表達可能并非來自于EZH2基因改變。Yan等[43]對38例NKTCL腫瘤組織和正常NK細胞進行免疫組化及染色質免疫沉淀對比分析，結果顯示EZH2在NKTCL中高表達（61%），在正常NK細胞中表達水平明顯減低（＜5%），但在高表達EZH2的NKTCL中并未發現EZH2基因異常改變。進一步研究發現，NKTCL存在某些miRNA如miRNA-26a、miRNA-26b和miRNA-101，它們可以特異性結合EZH2基因的保守序列，降低基因轉錄水平。而在NKTCL中，MYC基因的激活可引起上述miRNA的下調，繼而引起EZH2的高表達。上述結果提示，EZH2的過表達可能來自于上述miRNA的下調。采用RNA干擾技術針對轉錄后水平的調節可能是EZH2過表達NKTCL的另一治療靶點。

EZH2除影響組蛋白甲基化抑制基因轉錄外，還有復雜的非組蛋白依賴性致癌作用。Yan等[44]發現，JAK3可磷酸化EZH2蛋白，促使其從PRC2上分離，降低H3K27me3水平；同時磷酸化的EZH2蛋白作為轉錄共刺激分子，上調與DNA復制、細胞周期、生物合成、干細胞轉化及腫瘤浸潤相關的基因；JAK3抑制劑可明顯減少NKTCL細胞系的增殖。由此可推測，JAK3及相關通路有望成為EZH2過表達NKTCL患者治療的新靶點。

2.3 PRDM1基因

有研究報道，約40%的NK或T細胞淋巴瘤組織中可見6q21缺失，引起一些重要抑癌基因缺失，包括PRDM1、ATG5、ATM1、FOXO3和HACE1等[45-46]。

PRDM1，也稱Blimp-1，是一種具有鋅指結構的轉錄抑制因子，被認為是B細胞向漿細胞分化的最終調控因子[47]。許多研究表明，PRDM1基因失活在NKTCL中廣泛存在，與NKTCL發病有密切關系[45-46]。許多關于NKTCL腫瘤組織或細胞系的研究發現，PRDM1蛋白低表達不僅見于PRDM1基因缺失者，無PRDM1缺失或突變、PRDM1高轉錄者也存在PRDM1蛋白低表達[45，48]。由此可見，PRDM1致病機制復雜，可能涉及基因及表觀遺傳學等多方面異常。目前認為，PRDM1失活有如下機制：6q21缺失引起的PRDM1基因缺失、DNA甲基化（PRDM1前體CpG甲基化）、miRNA抑制（miRNA-9、miRNA-30b和miRNA-223）、其他轉錄抑制因子（BCL-6、LMP1）及信號通路的異常等[45-46，48-49]。

PRDM1是NKTCL致病相關的重要抑癌基因。正常NK細胞PRDM1基因敲除后細胞增殖明顯增加；相反，轉入PRDM1基因后PRDM1表達增加，腫瘤細胞停滯在G2/M期，促進細胞凋亡[45]。此外，PRDM1的表達可能會影響細胞增殖相關的基因表達MYC、4-1BBL以及TNF-α的表達，同時也對細胞周期負性調節因子CCNG1和CCNG2的表達產生影響[45]。針對PRDM1失活的基因添加、DNA去甲基化、RNA干擾治療，以及相關基因的調節可能成為PRDM1異常改變的NKTCL治療新手段。

2.4 JAK 3/STAT相關基因

JAK屬于細胞質內非受體酪氨酸激酶，介導細胞因子（如白細胞介素-2，白細胞介素-7）、生長因子、血小板衍生生長因子、IFN等信號向核內轉導。JAK家族包括JAK1、JAK2、JAK3及TYK2，分別負責轉導不同的入核信號。JAK3主要存在于造血細胞中，在淋巴細胞發育中起重要作用。在結構上，JAK3包含SH1～SH7 7個結構域，其中SH1為假激酶域，與激酶域結構類似但無激酶功能，是最常見的突變部位。

新加坡的一項研究首次證實了NKTCL存在JAK3基因突變，并引起JAK/STAT通路的持續激活[50]。在該研究中，35.4%（23/65）的NKTCL患者腫瘤組織檢測到JAK3基因突變（JAK3A572V和JAK3A573V）；體外研究進一步證實，JAK3基因突變可導致JAK/STAT信號通路持續激活，且該效應不依賴于白細胞介素-2等細胞因子的存在，最終導致細胞失控性增殖。后續許多研究發現，在NKTCL中也存在JAK3（JAK3V722L、JAK3Y652D等）、STAT3、STAT5B突變引起的JAK/STAT通路異常激活，可能也是NKTCL重要的致病機制[17，50-52]。

JAK3磷酸化可能是獨立于JAK3基因突變的引起JAK3/STAT通路激活的另一種重要機制。國內的一項研究采用外顯子測序技術對19例NKTCL石蠟標本進行分析，4例檢出JAK3基因突變，其中3例為同義突變，1例為無義突變，而30.8%的患者存在JAK3蛋白磷酸化[53]。法國的一項研究中，87%的NKTCL患者存在JAK3蛋白磷酸化，而JAK3突變比例小于20%[54]。上述兩項研究提示，相較于JAK3基因突變，JAK3蛋白磷酸化可能是NKTCL更常見、更直接的致病機制。

目前針對JAK3/STAT通路的抑制劑被廣泛用于腫瘤及自身免疫性疾病的臨床前及臨床研究，其中JAK抑制劑——tofacitinib已經被美國FDA批準用于類風濕關節炎的治療、ruxolitinib用于骨髓增殖性腫瘤的治療[16]。tofacitinib是一種口服、選擇性JAK3抑制劑，體內及體外試驗證實可抑制JAK3/STAT通路異常激活，抑制NKTCL腫瘤細胞增殖[55]。此外，研究發現EBV陽性的NKTCL中普遍存在JAK3/STAT5通路異常激活，而tofacitinib可使細胞周期停滯在G1期，減少EBV感染NK細胞LMP1和EBNA1的表達[28]。PRN371是針對JAK3的高選擇性抑制劑，對JAK3的親和力是JAK1/JAK2/TYK2的結合能力的282～1194倍。PRN371可明顯抑制JAK3/STAT通路異常激活相關的NKTCL細胞系增殖，抑制集落形成、誘導腫瘤細胞凋亡[17]。目前針對NKTCL的JAK3/STAT通路的靶向藥物研究均處于臨床前試驗階段，因此需要進一步擴大樣本的臨床試驗證實相關治療的作用及安全性。

2.5 TP53基因

TP53是研究最廣泛的抑癌基因之一[56]。TP53基因編碼的腫瘤抑制蛋白p53可以應對多種刺激，調節靶基因的表達，進而誘導細胞周期阻滯、衰老、DNA修復、凋亡等。該基因的突變與多種人類腫瘤及不良預后相關。

TP53基因突變或缺失是皮膚T細胞淋巴瘤蕈樣霉菌病/sezary綜合征（MF/SS）最常見的基因異常（83%）[57]。NKTCL中也存在有TP53基因突變，其突變情況具有地域差異：中國58%，日本南部地區50%，日本中部地區22%，韓國20%，墨西哥24%[58]。Takahara等[59]在一項包含32例NKTCL患者的隊列研究中檢出6例TP53的7-9號外顯子突變，其中4例錯義突變，2例無義突變；錯義突變的患者均有p53高表達。研究發現，TP53錯義突變與LMP1表達相關（P=0.038），但與p53表達無關。K-M曲線分析，TP53突變是影響無進展生存及總生存的獨立預后因素（P=0.021、0.034），合并突變患者的預后相對較差（5年OS，0vs32%，P=0.021）。

p53表達可能是NKTCL的重要預后因素，但TP53基因改變與p53表達之間的關系目前尚不明確。中國的一項研究顯示，33.3%（28/84）的NKTCL存在p53高表達，且p53高表達與腫瘤分期（P=0.016）、IPI評分（P=0.026）密切相關；p53表達情況和IPI評分可作為NKTCL患者的獨立預后因子（P=0.002，P=0.016）[60]。日本的一項研究分析了51例NK或T細胞淋巴瘤患者TP53基因突變及表達情況，發現TP53基因改變與表達情況不平行，p53高表達者占37%，突變者只占17.8%[61]。鑒于大多數研究均為小樣本研究，TP53基因異常、p53表達與NKTCL預后的相關性仍需進一步擴大樣本、長期隨訪的研究證實。

2.6 BCOR基因

BCOR位于染色體Xp11.4，編碼的BCOR蛋白是BCL6的共抑制因子，與生發中心B細胞發育密切相關，已有研究證實特異性I類和Ⅱ類組蛋白去乙?；缚膳c該蛋白相互作用[62]。

BCOR基因變異在NKTCL中高度特異，突變率可達 21%～32%[51，62]。Dobashi等[63]對日本 25 例NKTCL的研究發現，BCOR突變（32%）是最常見的體細胞突變。Tanaka等[62]首先證實了BCOR缺失突變與T細胞淋巴瘤的發生相關，在BCOR基因缺失突變的T細胞淋巴瘤細胞系中，MYC等Notch1通路的靶分子上調，影響轉錄及凋亡。此外，BCOR可能與RING1B、PCGF1、KDM2B、PRC1等相互影響，參與腫瘤的發生進展[62，64-65]。鑒于BCOR變異的高頻及模式，目前認為BCOR在NKTCL中作為抑癌基因發揮作用，多種形式的突變最終造成基因失活，參與腫瘤的形成。

2.7 DDX 3 X基因

DDX3X基因位于染色體Xp11.3-11.23，是一種ATP依賴性RNA解旋基因。野生型DDX3X蛋白具有下調核RelB表達和降低細胞ERK磷酸化水平的作用，使細胞增殖受抑，具有抑癌基因產物特征。而DDX3X基因突變導致其編碼蛋白功能失活，引起細胞過度增殖。

在NKTCL中存在DDX3X高頻突變，在部分研究中其突變率居于各基因突變的首位。Jiang等[14]分析105例NKTCL患者基因的外顯子測序結果，發現20%的患者合并DDX3X突變，是最多見的突變。和野生型DDX3X蛋白相比，突變型基因產物的RNA解旋能力弱，激活了NK-κB通路，失去對NK細胞周期進展的抑制作用。研究認為，與IPI類似，TP53和DDX3X是NKTCL患者獨立預后因素，突變型患者預后差。該研究根據臨床預后指標與基因突變情況將患者進行風險分層：低危組（IPI0～1，TP53/DDX3X野生型），中危組（IPI0～1，TP53/DDX3X突變型；IPI2～5，TP53/DDX3X野生型），高危組（IPI2～5，TP53/DDX3X突變型）。根據該預后模型，3組患者的2年總生存率分別為（95.8±4.1）%、（57.2±8.9）%和（13.4±8.8）%（P＜0.01）；2年無進展生存率分別為（93.5±4.5）%、（50.5±9.3）%和（7.8±7.4）%（P＜0.01）。盡管該研究中位隨訪時間僅為18個月，但研究結果提示，將基因情況加入到預后分層中可能對未來NKTCL治療模式的選擇具有重要指導意義。

3 小結與展望

隨著新技術的發展，基因檢測更加普遍，對于不同腫瘤相關基因的研究受到越來越多的關注。目前在NKTCL中基因檢測相關研究提示，基因異常改變可能在NKTCL發生、發展及預后評價中均有重要意義。由于該過程涉及基因、RNA、蛋白質、細胞因子等多種組分、龐大的調控網絡及機制，需要大量轉化研究進行分析、證實；期待越來越多的研究成果轉化為臨床診療手段。