干細胞移植后示蹤技術的研究進展

劉志燕 龍瀛 何曉曉 周曉

【提要】 干細胞具有再生和分化的能力，干細胞移植已經越來越多地應用于疾病的治療。在干細胞移植的實驗研究中，需要對干細胞進行標記，來觀察和追蹤其在宿主內的分布和增殖等情況。目前，干細胞標記主要分為直接標記和間接標記。直接標記即將標記試劑直接引入到干細胞中，間接標記是將報告基因整合到細胞中，繼而檢測基因表達產物。本文對現有的干細胞示蹤技術的優缺點和研究進展進行綜述。

干細胞是指能夠自我更新并分化為不同類型細胞的未分化細胞，依據其來源可分為兩種類型：胚胎干細胞和成體干細胞。由于干細胞具有分化為特定細胞的能力，已經越來越多地應用于各類疾病的治療，如肺纖維化、慢性阻塞性肺疾病、視網膜疾病和新生兒顱腦損傷等，取得了重大進展[1-5]。干細胞在移植后可以遷移到損傷和病變的部位，然后分化為靶細胞并定植于損傷部位，發揮治療作用[6]。

在干細胞研究中，需要通過標記干細胞，以觀察和追蹤其在宿主體內的遷移、分布、增殖和分化等情況。目前，有兩種細胞示蹤技術應用于干細胞療法，一種是用分子探針直接標記細胞，另一種是用報告基因間接標記細胞[7-8]。為了更好地了解干細胞在體內的生物學行為，選擇合適的示蹤技術至關重要。本文比較各種示蹤技術的優缺點，并對目前干細胞示蹤技術的研究進展進行綜述。

1 直接標記

在干細胞標記中使用最多的就是直接標記，即將標記試劑引入到移植的細胞中。直接標記不會對細胞進行遺傳修飾，具有安全可靠的優點。但是，隨著細胞的分裂，每個細胞中的標記物會逐漸減少或消失，從而影響干細胞的示蹤。

1.1 磁共振對比劑標記

此方法是移植前用MR對比劑標記移植細胞，然后利用磁共振成像（MRI）對細胞進行追蹤。MRI具有較高的時間和空間分辨率，且無放射性損害，使其逐漸成為活體細胞示蹤的研究熱點[9-10]。磁共振示蹤劑的種類較多，包括氧化鐵顆粒、順磁性物質和19F等。

氧化鐵顆粒依據顆粒大小又分為：超順磁氧化鐵顆粒（SPIO，直徑 50～200 nm），超小超順磁氧化鐵（USPIO，直徑 35 nm）和微米順磁氧化鐵納米粒子 （MPIO，直徑約1 μm）[11]。MPIO含鐵量最高，最敏感，但因其不能被生物降解、長期存留在體內而限制了其在研究和臨床中的應用[12]。SPIO標記細胞后與血紅蛋白結合或參與其他代謝過程，能被生物降解，是目前為止唯一被用于臨床的對比劑[13]。由于細胞膜表面和未修飾的SPIO均帶負電荷，使SPIO顆粒難以被細胞攝入，需要在SPIO表面修飾轉染試劑來提高標記效率。Horak等[14]發現，與沒有修飾的SPIO相比，兔BMSC對表面修飾D-甘露糖的SPIO顆粒攝取量明顯提高，且細胞功能、活性和增殖能力均未受影響。此外，用多聚賴氨酸表面修飾的SPIO標記人間充質干細胞，發現修飾后的SPIO攝取率達92%，并在大腦病變區通過MRI示蹤到了移植的干細胞[15]。Karussis等[16]用SPIO標記間充質干細胞后移植到多發性硬化癥和脊髓側索硬化癥患者體內，用MRI觀察到細胞的分布和分化，且未發現SPIO導致的細胞病理改變，說明SPIO在臨床上是安全可行的。但是，SPIO作為示蹤劑也存在不足：①靈敏度較低；②SPIO濃度隨著細胞分裂而逐漸稀釋；③標記細胞死亡后釋放的SPIO被其他細胞吞噬，造成假陽性[17]；④SPIO的標記效率與用量有關，但高劑量的SPIO會導致細胞活力降低[18]。

用于MRI對比劑的順磁性物質主要有釓 （Gd3+）和錳（Mn2+）兩類，但是Gd3+和Mn2+都有細胞毒性，限制了其在生物體內的應用。Gd2O3@MCM-41是一種釓的新型對比劑，與Gd3+相比，對細胞無毒性，且對細胞分化影響小。Shen等[19]用Gd2O3@MCM-41標記的神經干細胞移植小鼠體內后，用MRI追蹤了14 d。

19F作為對比劑敏感度高，且信號強度與19F的量成正比，故可用于量化標記的細胞[20]。Helfer等[21]的研究表明，用19F標記鼠BMSC會造成細胞活力的一過性降低，但很快恢復正常，并觀察到BMSC在脾臟內發育成正常的集落形成單位，說明標記了19F的BMSC仍具有分化治療作用。但是19F對細胞毒性的影響不明，還需要進一步的研究。

1.2 熒光標記

1.2.1 熒光染料的非特異性標記

不同的熒光染料可以與干細胞的細胞膜或細胞核等不同部位可逆或不可逆地結合，然后通過熒光顯微鏡可以觀察干細胞的遷徙和存活等情況。目前已有多種熒光染料被用于標記干細胞。

Dil是一種親脂性碳花青染料，因為能夠嵌入細胞膜的脂質雙分子層內做側向擴散運動，所以可以標記整個細胞膜。Dil對活體細胞沒有毒性，不會從標記的細胞轉移到未被標記的細胞，且熒光衰減率低，可用于觀察細胞遷移和分化情況[22]。韓明子等[23]成功將Dil標記小鼠骨髓細胞，并在肝臟中檢測到熒光，證明其來源于骨髓細胞。雖然Dil的細胞毒性低，但是會影響早期的細胞增殖，傳代后細胞內的熒光會衰減，也不利于干細胞的長期示蹤，只能用于細胞短期示蹤[24]。

Hoechst是一種雙苯酰亞胺類核熒光染料，細胞通透性高，可與細胞核內雙鏈DNA的堿基牢固結合，在紫外線激發下，能發出明亮的藍色熒光。Hoechst的標記率高，保存時間長，細胞毒性低。Lee等[25]將Hoechst標記的骨髓干細胞移植到小鼠體內4周后，仍能觀察到標記細胞。

在最近報道的熒光材料中，聚集誘導的發光熒光素（AIEgens）引起了生物學領域越來越多的研究興趣[26-28]。與常規有機染料不同，AIEgens是具有旋轉單元的螺旋槳形分子，由于分子運動的限制，只有在聚集形態時才能強烈發射[29-30]。AIEgen構建的生物探針，具有低背景干擾、高靈敏度和優異的耐光漂白性等優點。Yang等[31]將AIE粒子標記脂肪干細胞后植入小鼠放射性皮膚損傷部位，發現其能穩定追蹤ADSC，并且不影響ADSC的治療作用。

1.2.2 熒光染料的特異性標記

熒光染料的特異性標記即Y染色體標記。雄性物種與雌性物種相比，含有特殊的Y染色體。通過對Y染色體的長臂末端含有的一段重復序列進行熒光原位雜交，可對細胞進行示蹤，具有技術簡單、標記效率高等優點，并且時間、組織類型和細胞表型的變化對標記沒有影響[32]。Crain等[33]報道了將男性親屬的BMSC移植給女性患者后，對患者腦組織進行切片，檢測到了含有Y染色體的神經細胞，說明BMSC能夠分化為神經細胞。Dalakas等[34]將男性BMSC移植到女性酒精性肝病患者體內，用FISH成功檢測到Y染色體，證實了BMSC有向肝肌成纖維細胞分化的能力。然而，Y染色體標記的缺點是不能用于自體移植和女性供體時的示蹤。

1.2.3 熒光納米材料標記

量子點（QDs）是由硒化鎘制成的半導體熒光納米材料，具有寬的激發波長、窄的發光譜和強的發光性能等，已經越來越多地應用于活細胞的標記[35]。但是，量子點因為其結構特點而難以通過被動擴散的方式快速穿過細胞膜，故需通過吞噬、肽介導的轉運和受體介導的內化等方式進入細胞內[36-38]。Shah等[39]將多肽RGD偶聯的QDs與間充質干細胞一起培養后，發現間充質干細胞吞噬QDs后仍保持增殖和分化的特性。Lei等[40]將多肽Tat連接在聚乙二醇包被的QDs后標記間充質干細胞，然后將標記了的干細胞注射到小鼠尾部，最后在肝、脾和肺部都觀察到了熒光。Rosen等[41]用DQs標記的干細胞在心臟中維持了至少8周。這些研究表明，QDs可以作為探針標記自我更新和分化的干細胞，并且QDs在一定濃度范圍內對細胞形態和增殖沒有影響，也不影響細胞的正常生理代謝，可用于細胞的長期示蹤[42]。然而，由于大多數量子點有鎘離子，在高濃度時對標記細胞有生理毒性，影響標記細胞的增殖[43]。

2 間接標記

間接標記又可分為報告基因標記和核酸標記，即將DNA序列或核酸類似物整合到細胞基因組中，繼而編碼能夠產生對比的蛋白質或通過抗原抗體反應追蹤干細胞。使用這種標記技術，信號不會隨著細胞分裂而丟失，因為報告基因能與基因組基因一起復制，并且強度與細胞數量相關，所以也有利于細胞計數[44]。

2.1 報告基因標記

Liang等[45]將PRE9基因作為報告基因標記神經干細胞后移植到免疫缺陷小鼠腦內，并進行體內和體外發光鑒定，發現PRE9在620 nm處穩定發光，并且發射峰不受pH值影響，受組織吸光度的影響也很小。

1962年，Shimomura等[46]在水母體內分離出了一種由238個氨基酸組成的單體蛋白質，因為能在熒光顯微鏡下吸收400 mm的藍光并發出508 mm的綠色熒光，所以命名為綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）。 隨后，不同波長的熒光蛋白相繼被發現，包括黃色熒光蛋白（Yellow fluorescent protein，YFP）、藍色熒光蛋白（Blue fluorescent protein，BFP）和紅色熒光蛋白（Red fluorescent protein，RFP）等。 熒光蛋白基因通過病毒和質粒等載體與目的蛋白基因整合后，可以在宿主細胞內表達并在激發光照射下發出熒光。GFP對細胞的毒性作用和不良反應較小，細胞活力和完整性幾乎不受影響[47]。但野生型的GFP在發光強度和靈敏度方面較差[48]，目前使用較多的是人工突變體增強型綠色熒光蛋白（Enhanced green fluorescent protein，EGFP），EGFP 增強了 GFP 的熒光性能，改善了GFP的熱穩定性，有較好的發光強度和靈敏度。Pinero等[49]用EGFP標記了BMSC，研究其對坐骨神經髓鞘再生的作用，觀察到了至少持續60 d的熒光穩定表達。

但是，由于宿主基因對外源報告基因的沉默，報告基因可能在傳代后表達減少，這種情況在逆轉錄病毒轉染干細胞時尤為常見[50]。整合載體對細胞進行遺傳修飾還存在許多潛在的安全問題，更重要的是有可能激活附近的原癌基因，將想要標記的治療細胞轉化為惡性細胞[51-52]。因此，間接成像技術通常僅在終末期患者中使用[53]。

2.2 核酸標記

溴脫氧尿嘧啶（BrdU）是一種嘧啶類似物，是最具代表性的核酸標記物。BrdU在DNA復制時，可以與胸腺嘧啶競爭，加入到DNA的核酸序列中。BrdU被用來標記增殖期細胞，通過定量評估細胞合成DNA的水平，可以量化標記細胞。馬曉菁等[54]用BrdU成功標記了骨髓干細胞，在大鼠創面觀察到了陽性細胞的聚集。BrdU標記簡單易行，對細胞無毒性，但是BrdU需要DNA變性后才能與抗體結合，常導致染色彌散，移植了BrdU的細胞死亡后也會將其釋放出來污染鄰近細胞，出現假陽性[55]。5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（EdU）是另外一種胸腺嘧啶核苷類似物，無需DNA變性即可檢測，但EdU能降低干細胞的活力，損害細胞表型，應該避免EdU標記用于干細胞示蹤[56]。

盧榮等[57]用 Hoechst 33342、BrdU、GFP三種方法標記皮膚干細胞，結果顯示三種物質對細胞沒有明顯毒性作用。其中，Hoechst 33342的標記率最高，但隨著時間的延長熒光逐漸衰減；GFP標記最穩定，但標記率低；BrdU標記細胞較穩定，標記率也較高。

綜上所述，目前干細胞示蹤方法眾多，每種方法都有各自的優缺點，我們需要根據不同的細胞情況或實驗類型選擇最適宜的標記方法，以達到最好的示蹤效果。理想的示蹤方法應該具有簡單易行、特異性強、靈敏度高、細胞毒性低、受外界干擾小以及移植干細胞的長期定量等優點。隨著干細胞研究的不斷深入，干細胞示蹤技術也將得到不斷發展。